[發(fā)明專利]一種通過烏司他丁親和層析介質(zhì)制備純品烏司他丁的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410123449.7
• 申請日: 2014-03-31
• 公開（公告）號: CN103880951A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設計）人: 陳備戰(zhàn);辛瑜;熊蔚;劉蘭花
• 申請（專利權）人: 南昌市萬華生化制品有限公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/22
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術領域

本發(fā)明涉及一種制備烏司他丁的方法，具體涉及一種通過烏司他丁親和層析介質(zhì)制備純品烏司他丁的方法。?

背景技術

烏司他丁是一種Kunitz型的廣譜蛋白酶抑制劑，能夠有效的抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、乳糖酶、脂肪酶、透明質(zhì)酸酶和其他胰腺酶的活性。此外，其具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子（MDF）產(chǎn)生，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。烏司他丁還可改善手術刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術刺激引起的對內(nèi)臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環(huán)狀態(tài)等。?

其在臨床醫(yī)療中有廣泛的應用，適用癥包括急性胰腺炎（包括外傷性、術后及內(nèi)窺鏡逆行性胰膽管造影術后的急性胰腺炎）、慢性復發(fā)性胰腺炎的急性惡化期，急性循環(huán)衰竭（出血性休克、細菌性休克、外傷性休克、燒傷性休克）；也廣泛用于胸外科手術、消化系統(tǒng)手術、腫瘤手術、器官移植、器官切除手術及CPB手術；還用于治療與預防腫瘤化療產(chǎn)生的腎功能障礙。?

目前，日本的Mochida?Pharmaceutical?(Tokyo,?Japan)公司有較成熟的產(chǎn)品，分子量為67?kDa，國內(nèi)按中國藥典2013版規(guī)定，分子量要求為37～43kDa。然而烏司他丁的分離純化步驟通常包括了多步的硫酸銨沉淀，表面活化劑處理，熱處理，離子交換層析，分子篩層析等。而過多的純化步驟，導致了純化時間較長，蛋白和活性回收率較低的結果。?

為了大規(guī)模生產(chǎn)烏司他丁，必須減少分離純化的步驟。因此，需要提供快速高效的烏司他丁分離方法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種可克服上述現(xiàn)有技術中的缺點的烏司他丁制備方法，該方法利用了烏司他丁親和層析介質(zhì)，使純化烏司他丁可以大規(guī)模的快速制備。?

本發(fā)明的技術方案為：?

第一方面，一種烏司他丁親和層析介質(zhì)的合成方法，其合成方法如下：

（1）活化：取親和層析介質(zhì)sephadex,先用10-12倍純水洗滌，過濾抽干。再加入活化緩沖液A，在40-45℃下攪拌2.5-3.5h，然后過濾，再用純化水洗滌后過濾抽干；

（2）親水間隔臂的連接：活化后的親和層析介質(zhì)sephadex加含5%-10%的1，3-二氨基-2-羥基丙烷的水溶液，而后在加熱至60-70℃后攪拌，再用純化水洗滌后過濾抽干；

（3）疏水間隔臂的連接：加三聚氯嗪的水-丙酮溶液，通過氫氧化鈉調(diào)pH值至7.5-8.5，冷卻至4-8℃攪拌，再用純化水洗滌，過濾抽干；

（4）連接上親和配體：加聚賴氨酸水溶液，攪拌，調(diào)pH值至9-10，用純化水洗滌，過濾抽干即可；

所述親和層析介質(zhì)sephadex為sephadex?G75。

所述親和配體聚賴氨酸的分子大小為聚賴氨酸3000。?

?所述緩沖液A為0.5?M?NaOH,?10%?二甲亞砜，6%環(huán)氧氯丙烷。

第二方面，制備純化的烏司他丁，其制備方法如下：?

（1）取烏司他丁親和層析介質(zhì)，裝柱，用PH值為7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液沖洗平衡親和層析介質(zhì)。

（2）將含有烏司他丁粗品，加入2-3倍的水溶液進行解析，然后過濾、將溶液濃縮至3.5-4.5L，取濃縮液；?

（3）將上述（2）的濃縮液通過烏司他丁親和介質(zhì)進行吸附，然后采用pH值為7.0-8.0洗脫緩沖液B沖洗親和介質(zhì)，用以洗滌雜質(zhì)；

（4）最后用PH值為7.5-9.5的洗脫緩沖液Ｃ洗脫親和介質(zhì)上吸附的烏司他丁，收集純化后的烏司他丁溶液，濃縮、冷凍干燥即得。

所述緩沖液B為磷酸鹽溶液。?

所述緩沖液C為甘氨酸溶液。?

本發(fā)明通過烏司他丁親和層析介質(zhì)生產(chǎn)純品烏司他丁，可以大規(guī)模快速分離分子量為37-43的純化烏司他丁，可在僅用一步親和層析的情況下，得到烏司他丁純品，整個純化步驟消耗時間短，活性回收率可大于80%，同時比活比活大于5000?IU/mg.pr，符合中國藥典要求，適于大規(guī)模推廣應用。

附圖說明

圖1為聚賴氨酸3000的分子結構圖。?

具體實施方式

實施例1：

1烏司他丁親和層析介質(zhì)合成：