[發(fā)明專利]頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測試紙條及其制備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410123427.0
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN103901201A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒明強(qiáng);張帆;陳艷;胡佳麗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種獸藥殘留的熒光免疫速測技術(shù)，特別是涉及一種用于頭孢氨芐殘留檢測的熒光免疫層析檢測試紙條及其制備。

背景技術(shù)

頭孢氨芐(Cephalexin)是β-內(nèi)酰胺類抗生素。獸醫(yī)臨床廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等原因，均可造成它在畜產(chǎn)品中的殘留，給人類健康帶來嚴(yán)重危害。針對該藥物在食品中的殘留，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，牛奶中的最大殘留限量為100μg/kg，肌肉、脂肪中的最大殘留限量為200μg/kg。

目前，用于檢測頭孢氨芐的方法主要有微生物法、色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法、免疫分析法等。微生物檢測法操作簡單，但其檢測周期長且結(jié)果誤差較大。色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)雖然靈敏度高，但是樣品前處理及測定操作繁瑣、費(fèi)用高，不適于大量樣品的快速檢測。

Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)(fluorescent?antibody?technique)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用己知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，其中又以熒光抗體方法較常用。基于免疫熒光技術(shù)，同時結(jié)合色譜層析原理的分析方法稱為熒光免疫層析法，以其具有靈敏、快速、特異、簡便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩查。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查，用于檢測牛奶中頭孢氨芐藥物殘留量的熒光免疫層析檢測試紙條。

本發(fā)明所述的頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測試紙條，在背板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、涂覆有熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊制成頭孢氨芐殘留熒光免疫定量層析試紙條。

優(yōu)選地，所述結(jié)合墊上涂覆的稀土熒光納米顆粒的直徑范圍為50-100nm。

所述稀土熒光納米顆粒，可以發(fā)射的波長范圍是600-630nm，熒光納米顆粒含有稀土絡(luò)合物，在基態(tài)下是穩(wěn)定的，在激發(fā)光源(340-365nm)的作用下能夠發(fā)射出波長范圍在600-630nm的熒光。

優(yōu)選地，所述結(jié)合墊上涂覆的熒光納米顆粒標(biāo)記抗體為稀土熒光納米顆粒標(biāo)記頭孢氨芐單克隆抗體，硝酸纖維素膜上面包被有檢測線為頭孢氨芐與卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測試紙條的制備方法。

本發(fā)明所述的頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟：

A.頭孢氨芐單克隆抗體的具體制備過程為：

(1)動物免疫：采用雌性BALB/C純系小鼠作為免疫動物，以頭孢氨芐與載體蛋白牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原；

(2)細(xì)胞融合與克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

(3)單克隆抗體的制備與純化：使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑，5天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株10⁶個/只，7天后取小鼠腹水，進(jìn)行純化后得單克隆抗體分裝，-20℃保存。

B.熒光納米顆粒的醛基化：

取2mg熒光納米顆粒(20mg/mL，100μL)，以25mM的碳酸鹽緩沖液(pH＝9.5)洗滌3遍(12000r/min，4分鐘)后懸浮于100μL上述碳酸鹽緩沖液中。加入120μL醛基化的葡聚糖，混勻，短時超聲，避光反應(yīng)3-4小時(室溫)。以上述碳酸鹽緩沖液洗滌3遍(12000r/min，4分鐘)后，懸浮于100μL碳酸鹽緩沖液中。1500r/min離心1分鐘，去除雜質(zhì)，放置在4℃?zhèn)錁?biāo)記抗體之用。

C.熒光納米顆粒標(biāo)記頭孢氨芐單克隆抗體的制備：

將0.5mg頭孢氨芐單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液4℃透析過夜，與上述醛基化的熒光納米顆粒混合，4℃反應(yīng)過夜。然后，加入硼氰化鈉，終濃度為5mM，4℃反應(yīng)2-4小時。再加入等體積的封閉液(50mM?tris-HClpH7.8，含2％BSA、4％蔗糖)，封閉12小時或過夜；最后用50mM?tris-HCl?pH7.8洗滌標(biāo)記好的抗體3遍(12000r/min，4分鐘，4℃)，然后用100μL50mM?tris-HCl?pH7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.05％Tween-20)懸浮，4℃避光儲存?zhèn)溆谩?/p>