[發(fā)明專利]頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測試紙條及其制備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410123427.0
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN103901201A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設計）人: 鄒明強;張帆;陳艷;胡佳麗
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測試紙條，其特征在于：在背板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、涂覆有熒光標記抗體的結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，硝酸纖維素膜包被有檢測線為頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原和質(zhì)控線為羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體。頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測試紙條中各部分含有以下成分：

A.結合墊，上面涂覆有熒光標記抗體，所述標記抗體為稀土熒光納米顆粒與頭孢氨芐特異性抗體采用化學交聯(lián)法進行連接得到的偶聯(lián)物，具體制備過程為：

(1)頭孢氨芐-牛血清白蛋白免疫抗原的合成：將頭孢氨芐和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亞胺法進行偶聯(lián)得到免疫抗原。取頭孢氨芐15mg溶于5mL?PBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入25mg碳二亞胺(EDC)和10mg?N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌30分鐘，取BSA10mg溶于活化的頭孢氨芐溶液中，25℃攪拌反應2小時，再4℃反應過夜。4℃條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐免疫抗原，分裝凍存；

(2)動物免疫：采用雌性BALB/C純系小鼠作為免疫動物，以頭孢氨芐-牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原；

(3)細胞融合與克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞融合，篩選細胞株，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

(4)單克隆抗體的制備與純化：使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑，5天后腹腔注射雜交瘤細胞株10⁶個/只，7天后取小鼠腹水，進行純化后得單克隆抗體分裝，-20℃保存；

(5)免疫探針制備：取熒光納米顆粒用碳酸鹽緩沖液pH9.5離心洗滌，懸浮，加入醛基化的葡聚糖反應4h，加入上述頭孢氨芐單克隆抗體混合4℃過夜。加入硼氰化鈉溶液于4℃反應4h，洗滌、4℃儲存，備用。

B.硝酸纖維素膜，上面包被有檢測線和質(zhì)控線，檢測線為頭孢氨芐與卵清蛋白(OVA)采用戊二醛法進行偶聯(lián)得到的包被原，質(zhì)控線為羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體(羊抗鼠IgG)，具體制備過程為：

(1)頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原的合成：將頭孢氨芐和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法進行偶聯(lián)得到包被抗原。取頭孢氨芐10mg溶于5mLPBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入1％戊二醛溶液攪拌30分鐘，取OVA30mg溶于1mLPBS，加入到活化的頭孢氨芐溶液中，25℃攪拌反應2小時，4℃反應過夜。4℃條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐包被抗原，分裝凍存；

(2)羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作為抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗體球蛋白制成；

(3)分別用包被稀釋液將頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體調(diào)節(jié)到0.3-1.0mg/mL，膜液量為25μL/25-30cm，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質(zhì)控線間隔4-7mm，然后于37℃下烘干2小時。

C.樣品墊，具體處理為：將玻璃纖維膜浸泡于0.2mol/LTris-HCl(pH7.8)，1.0％TritonX-100，3.0％BSA的處理液中，于4℃條件下浸泡2小時；然后于37℃下烘干2小時，備用。

2.根據(jù)權利要求1所述的試紙條，其特征在于：所述試紙條在制備過程中所用的包被緩沖液為pH7.8，0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液。

3.根據(jù)權利要求1所述的試紙條，其特征在于：所述熒光納米顆粒發(fā)射的波長范圍是600-630nm。

4.一種利用權利要求1所述的頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測試紙條檢測頭孢氨芐殘留的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)樣品前處理：牛奶樣品離心(12000r/min，10分鐘)脫脂后直接測定；

(2)用試紙條檢測：在試紙條的上樣點直接滴加上述離心脫脂牛奶樣品，層析15-20分鐘后，測615nm處的熒光強度值；

(3)檢測結果分析：

用所獲得的每個濃度的標準品溶液的檢測線的熒光強度平均值(H)除以第一個標準品溶液(0標準)的檢測線熒光強度值(H₀)再乘以100％，得到百分檢測線熒光強度值；計算公式為：檢測線百分熒光強度值(％)=(H/H₀)×100％；公式中H為標準溶液的檢測線平均熒光強度值，H₀為0μg/L標準溶液的檢測線平均熒光強度值；以頭孢氨芐標準品濃度的半對數(shù)值為X軸，檢測線百分檢測線熒光強度值為Y軸，繪制標準曲線圖；用同樣的辦法計算樣品溶液的檢測線百分熒光強度值，相對應出一個樣品的濃度，從標準曲線上讀出樣品中頭孢氨芐的殘留量。