[發明專利]痕量RNA實時動態檢測方法

在審

• 申請號: 201410122611.3
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103882132A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 羅陽;邱曉沛;張洪;蔣天倫
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及檢驗技術領域，尤其涉及的是一種痕量RNA實時動態檢測方法。

背景技術

核糖核酸RNA是存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體，對基因的表達與蛋白質生物合成起重要的作用。在生物體內主要有四種不同的RNA分子，分別是信使RNA（mRNA）、轉移RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）。它們參與各種各樣的調節途徑，包括發育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。最近的研究發現，miRNA表達與多種癌癥相關，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能。要了解RNA在基因調控中扮演的角色，很關鍵的一個方法就是迅速、準確地定量檢測RNA基因的表達。因此如果早期能對疾病進行分子水平RNA的檢測，將為疾病的早期診斷提供重要的依據。

但是由于小分子RNA是一類很小的分子，部分小分子RNA表達水平極低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。傳統常用的檢測方法有Northern?blot技術、RNA芯片技術和實時定量PCR技術三類。Northern?blot技術是驗證和確認RNA的重要方法,但該方法操作繁瑣并且靈敏度低,不適用于臨床樣本的高通量檢測芯片技術檢測方法可以實現快速、高通量的檢測，但其需要的RNA初始樣本量大，并且以雜交為基礎，因此無法區分單堿基差異的RNA，再者，芯片技術檢測的結果為半定量，該方法的重現性和準確性較差,一般多用于初篩。實時定量PCR技術可以定量分析RNA的表達，且樣本需要量較少，顯著提高了敏感度，但對于miRNAs檢測存在以下問題，由于成熟miRNAs長度較短，難以針對成熟miRNAs設計有效的特異性引物和探針，只能用前體miRNAs來代替，因此無法真實體現相應的成熟miRNAs水平。另外，實時定量PCR是基于體外擴增的技術，易受擴增溫度的影響，后來演變出以滾環擴增（RCA）技術為代表的等溫擴增技術，可以實現低豐度核酸的等溫檢測。然而該技術同樣存在著如下缺陷，當前，RCA均相檢測RNA多采用熒光染料與DNA產物相結合并產生強熒光進行檢測，但由于熒光染料與溶液中的DNA和RNA都能結合，在實際樣品分析時易使檢測的背景值偏高，降低檢測的靈敏度。并且，上述實時定量PCR技術、RCA技術都是是以擴增為基礎，檢測結果的特異性存在風險，極大的限制了核酸檢測技術的應用。因此，實現無需熒光標記無需核酸擴增的低豐度核酸直接檢測和實時動態監測將是方法學上的一大突破。

雙鏈特異性核酸酶(Duplex-specificnuclease,DSN)能夠選擇性降解DNA-RNA雜交體中的DNA,對單鏈核酸分子幾乎沒有作用，因此是構建RNA文庫中的最經典工具之一。近年來，有文獻報道了將DSN用于miRNA檢測，其原理也是基于DSN能夠選擇性降解DNA-RNA雜交體中的DNA。通過使體系中RNA與DNA探針雜交，再運用DSN酶切DNA-RNA雙鏈中的DNA單鏈，使RNA單鏈游離后繼續與預先包被的DNA探針進行雜交。重復上述“雜交-酶切-游離”過程即可實現檢測信號的放大。然而上述方法有兩個問題尚無法克服：1）miRNA檢測技術是基于終點觀測，無法動態觀測miRNA-DNA結合與選擇性酶切這一動態過程，因此檢測結果的可靠性受到質疑。2）由于芯片上的包被的DNA數量是有限的（過高則存在較大空間位阻，過低則靈敏度差），從而使得上述miRNA檢測的最低檢出限差，無法真正實現臨床樣本中低濃度miRNA的無擴增直接檢測。

表面等離子體共振（SPR）技術可以實時動態監測生物大分子間的反應，是觀測生物分子結合與解離的可靠檢測技術。本發明擬通過SPR技術平臺構建能夠實時動態監測痕量RNA的核酸檢測技術。并且通過發明一維碳納米材料石墨烯金膜包被技術和納米金修飾探針技術，數量級放大已包被的DNA探針質量信號，結合DSN的循環酶切技術，從而指數級提高檢測靈敏度，從而實現RNA的無需擴增直接檢測與動態觀測。最終建立一套“可視化”DSN信號放大RNA實時動態監測方法，以期為疾病的早期診斷提供可靠技術支撐（原理如圖1所示）。為增強檢測方法的靈敏度，引入了一種吸附性很強的石墨烯，通過構建的石墨烯芯片實現高效包被DNA探針，同時，對DNA探針進行納米金修飾，增加探針的質量，從而增大SPR的監測信號。另外，石墨烯芯片上的石墨烯可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，避免造成SPR信號干擾。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的靈敏度不足和無法實時動態觀測的問題提供一種痕量RNA實時動態檢測方法。

本發明的技術方案如下：