[發(fā)明專利]痕量RNA實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410122611.3
• 申請(qǐng)日: 2014-03-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103882132A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅陽(yáng);邱曉沛;張洪;蔣天倫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種痕量RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

A1、首先進(jìn)行DNA探針在芯片上的包被；包括如下方法：石墨烯系統(tǒng)，純金膜-巰基系統(tǒng)，短鏈羧化物-氨基系統(tǒng)(如常用的鏈酶親和素-生物素)；

A2、然后將待檢痕量RNA與預(yù)先包被的DNA探針雜交，再加入DSN酶以降解雜交雙鏈中的DNA，使RNA游離出來(lái)與DNA探針雜交，進(jìn)而RNA-DNA復(fù)合物中的DNA繼續(xù)被DSN降解，再次使RNA游離出來(lái)，重復(fù)上述過(guò)程，可以使體系中所有RNA-DNA復(fù)合物中的DNA均可被DSN酶降解；

A3、由于芯片上包被的DNA探針的量與SPR角度值成正相關(guān)，隨著芯片上的DNA探針被逐漸酶切，導(dǎo)致其SPR角度值逐漸改變，利用表面等離子體共振（SPR）平臺(tái)，可觀測(cè)每個(gè)時(shí)刻SPR角度值的變化，其反映了檢測(cè)RNA每個(gè)時(shí)刻的情況，通過(guò)該SPR角度值的變化可對(duì)靶分子RNA進(jìn)行快速定量實(shí)時(shí)檢測(cè)；本方法可根據(jù)酶切完全時(shí)間來(lái)定量RNA，或者確定某一時(shí)刻根據(jù)相應(yīng)的SPR角度值來(lái)定量RNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的痕量RNA實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，其特征在于：

A1、為了增大DNA探針在SPR上的監(jiān)測(cè)信號(hào)，以納米金修飾DNA探針；

A2、構(gòu)建了石墨烯芯片以高效包被DNA探針，確保檢測(cè)的靈敏度；同時(shí)，石墨烯可以將納米金與芯片上的金膜物理隔離，從而避免SPR信號(hào)干擾；

A3、酶切過(guò)程中加入的雙鏈特異性核酸酶（DSN）的反應(yīng)溫度可在20℃-50℃，這里首選37℃作為反應(yīng)最適溫度；

A4、為了增強(qiáng)DSN酶在反應(yīng)過(guò)程中的活性，可加入一定濃度SDS,巰基乙醇，或者H₂O₂水溶液；

A5、本方法利用表面等離子體共振（SPR）平臺(tái)，可完成檢測(cè)過(guò)程中對(duì)RNA水平的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。