[發明專利]在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fa1的方法

有效

• 申請號: 201410119119.0
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103937816A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 朱軍;張欽斌;李平;鄧其明;李雙成;劉懷年;王世全;王玲霞;鄭愛萍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C12N15/75;C12N1/21;C12N15/11;C12N15/84;A01H5/00;A01H4/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種在水稻中高效表達Bt蛋白Cry30Fa1的方法。

背景技術

褐飛虱（Nilaparvata?lugens?）又稱褐稻虱，屬同翅目（Homoptera），飛虱科（Delphacide），是一種遍布世界的遷飛性害蟲，是危害亞洲稻作區最嚴重的害蟲之一，嚴重影響水稻的產量及其品質，我國褐飛虱的年發生面積為1330-2000萬hm²，大約占水稻種植面積的1/2。褐飛虱對水稻的危害主要表現為以下幾方面：1）成蟲和若蟲群集于稻叢基部，刺吸水稻莖葉韌皮部中汁液，消耗稻株營養；受害重時，稻株下部變黑、腐爛發臭和癱瘓倒狀。2）成蟲產卵時刺傷稻株莖葉組織，形成大量傷口，促使水分由刺傷點向外散失，同時輸導組織破壞，同化作用減弱，加速稻株倒伏。3）褐飛虱還是傳播水稻病毒病的蟲媒，可以傳播或誘發水稻病害。此外，褐飛虱取食或產卵時造成的大量傷口，有利于水稻紋枯病等病菌的侵染；取食危害時排泄的“蜜露”，富含各種糖類和氨基酸，覆蓋在稻株上，易招致病菌的孳生。

長期以來，主要依賴于化學農藥來防治褐飛虱，但是傳統單藥劑控制方法已經很難滿足現實生產的需求，且濫用化學殺蟲劑會導致環境污染和生態環境破壞等問題。另外，褐飛虱生物型的改變、食物鏈的豐富以及對主治藥劑吡蟲啉等產生抗性的一些因素促使了褐飛虱的反復暴發。因此，世界上許多國家都在不斷挖掘和利用抗褐飛虱基因，進而選育具有持久抗蟲性水稻品種。

研究者陸續從水稻抗褐飛虱品種中定位了一系列抗飛虱主基因，目前為止，已經鑒定了水稻中35個褐飛虱抗性位點，其中4個已被克隆，并培育出一系列抗褐飛虱水稻品種。另外，對同翅目害蟲具有控制作用的基因，還包括膽固醇氧化酶基因、大豆胰蛋白酶抑制(SKTI)基因和雪花蓮外源凝集素(GNA)基因。由于GNA蛋白對人的毒性極低，但對褐飛虱、黑尾葉蟬有極強的毒殺作用，同時還能抑制蚜蟲的生長，因而已經應用于轉基因水稻中。這些抗性品種的推廣在一定階段緩解了褐飛虱的危害，獲得了較大的經濟效益，也為發展環境友好型和資源節約型農業做出了重要貢獻。

然而，褐飛虱具有快速演變形成新的生物型以適應新的抗蟲品種的能力，使一系列單一抗性的水稻品種往往很快就被新的生物型所危害，如IR26僅推廣兩年就喪失了抗性，而IR36的抗性也僅維持了8年。因此，篩選對褐飛虱具有獨特殺蟲機理的新型基因，結合分子輔助選擇技術聚合多個抗蟲基因或QTL，已成為防治褐飛虱危害和減輕抗蟲品種對褐飛虱的選擇壓力，延長品種使用年限的首要任務。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus?thuringiensis,Bt）是一種革蘭氏陽性細菌，在形成芽胞的同時能產生對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、同翅目、線蟲等多種害蟲具有特異殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal?Crystal?Proteins,ICPs），編碼這些蛋白的基因稱為cry或cyt基因。這些殺蟲晶體蛋白具有對人畜無害、環境友好的特點。因此，廣泛應用于農業、林業、衛生等領域的害蟲防治，成為世界上應用最廣、產量最大的微生物殺蟲劑；同時其殺蟲基因已成功地應用到轉基因抗蟲植物中，是轉基因抗蟲植物主要的基因來源。

編碼殺蟲晶體蛋白的基因稱為cry或cyt基因，由國際Bt殺蟲基因命名委員會正式命名，主要是根據殺蟲基因編碼的氨基酸序列的同源性進行分類；由于氨基酸序列差異與殺蟲特異性及毒力有密切的相關性，命名委員會規定與已知蛋白同源性低于95%即為新的模式基因(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html)。目前，研究者已從世界各地的昆蟲、土壤和植物體表等樣本中分離到數萬株Bt菌株，并從中挖掘出從Cry1～Cry73類殺蟲晶體蛋白，但是對昆蟲高毒力Bt菌株和Cry蛋白卻鮮有報道。

Bt及其殺蟲晶體蛋白的應用主要集中在三個方面：1）直接工業化生產；2）構建工程菌，進而轉化生產；3）培育轉基因抗蟲植物。目前商業化應用的Cry蛋白主要有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry3A、Cry3B，Cry8A，Cry8B和Cry34/Cry35。Bt及其殺蟲晶體蛋白對植物害蟲、衛生害蟲的綠色防治做出了巨大貢獻。