[發明專利]一種TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制備方法和應用在審

申請號：	201410119036.1	申請日：	2014-03-27
公開（公告）號：	CN104086656A	公開（公告）日：	2014-10-08
發明（設計）人：	孫愛友;魏東芝;徐瑞;王麗華;趙志強	申請（專利權）人：	華東理工大學
主分類號：	C07K19/00	分類號：	C07K19/00;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/62;C12N15/70;C12P21/06;A61K38/17;A61K47/48;A61P35/00
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種 tat rhogdi2 融合蛋白及其制備方法應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其是涉及一種TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制備方法和應用。?

背景技術

在泌尿系統中，膀胱移行細胞癌作為一種最常見的惡性腫瘤，發病率越來越高。膀胱癌的發生是內在的遺傳因素和外在的環境因子相互作用的結果，包括一系列非常復雜的病理變化。腫瘤切除后膀胱癌細胞轉移是造成病人死亡的最主要原因。在膀胱癌中，RhoGDI2對腫瘤轉移表現出抑制作用，被確定為腫瘤轉移抑制因子。臨床數據也顯示RhoGDI2的低表達與病人腫瘤發生轉移和預后狀況變差有一定的相關性。目前，RhoGDI2具體的作用途徑還不清楚，但已發現內皮素1(ET-1)和神經介素U(NmU)是RhoGDI2下游的兩個作用靶點。它們都是G蛋白耦聯受體的激活劑。內皮素1是由21個氨基酸組成的，參與血管收縮、組織分化和修復等活動。在腫瘤轉移過程中，形成利于轉移的循環模式，這種循環模式也存在于肺和腎等內皮素反應組織中。內皮素(ET-1)可以與膀胱癌發生轉移的主要部位(骨和肺)直接作用。間接地激活缺氧誘導因子-1α和血管內皮生長因子(VEGF)。內皮素1(ET-1)和血管內皮生長因子(VEGF)能夠刺激血管平滑肌細胞和內皮細胞的增生，從而促進腫瘤的生長。RhoGDI2通過抑制這兩種蛋白來影響相應的信號通路。神經介質U(NmU)的生物學作用與腫瘤微環境有關，可以影響腫瘤的生長和轉移。RhoGDI2有可能從細胞質轉位到細胞核，與其他的信號分子發生作用，間接地調節NmU在基因轉錄水平上的表達。此外，研究發現多功能蛋白聚糖(versican)在許多有侵襲轉移特征的癌組織中都有表達，它有利于腫瘤細胞的增殖、粘附和遷徙并且可以調節腫瘤細胞在微環境中與基質的相互作用。通過改變腫瘤微環境中的炎癥來抑制腫瘤的轉移可能是RhoGDI2的一種作用機制。?

RhoGDI2已經被確定為膀胱癌細胞的轉移因子，能夠有效地抑制細胞的遷移?和侵襲。RhoGDI2重組蛋白有發展為抗腫瘤的藥物的潛力。迄今為止，RhoGDI2的研究還集中在探究其作用機制這部分，關于運用基因工程技術大量制備RhoGDI2蛋白，并將其用于抑制腫瘤細胞轉移的研究尚未見報道。?

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種高濃度、高純度的TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制備方法和應用。?

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：?

一種TAT-RhoGDI2融合蛋白，為TAT穿膜肽融合到RhoGDI2蛋白的氮端，形成的融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。?

所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述的RhoGDI2蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。?

編碼該融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。?

一種TAT-RhoGDI2融合蛋白的制備方法，該方法包括以下步驟：?

(1)構建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重組質粒；?

(2)利用大腸桿菌DH5α異源表達GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；?

(3)分離純化TAT-RhoGDI2融合蛋白。?

步驟(1)所述的構建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重組質粒具體包括以下步驟：?