[發(fā)明專利]一種TAT-RhoGDI2融合蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410119036.1
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN104086656A
• 公開（公告）日: 2014-10-08
• 發(fā)明（設計）人: 孫愛友;魏東芝;徐瑞;王麗華;趙志強
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/62;C12N15/70;C12P21/06;A61K38/17;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

1.一種TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，為TAT穿膜肽融合到RhoGDI2蛋白的氮端，形成的融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述的RhoGDI2蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種TAT-RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，編碼該融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

4.一種如權(quán)利要求1～3任一所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)構(gòu)建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重組質(zhì)粒；

(2)利用大腸桿菌DH5α異源表達GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；

(3)分離純化TAT-RhoGDI2融合蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種TAT-RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的構(gòu)建pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重組質(zhì)粒具體包括以下步驟：

a.以序列如SEQ?ID?NO：5所示的上游引物和序列如SEQ?ID?NO：6所示的下游引物為反應引物，以全長的RhoGDI2基因為模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：7所示，PCR反應，獲得TAT-RhoGDI2融合蛋白的編碼基因，即目的基因；

b.膠回收上述PCR產(chǎn)物，將目的基因和pGEX-4T-2表達質(zhì)粒用BamH?I和EcoR?I進行雙酶切，T4連接酶連接后，獲得pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，挑選陽性克隆送樣測序。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種TAT-RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述的PCR反應的條件是：94℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種TAT-RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的利用大腸桿菌DH5α異源表達GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白具體包括以下步驟：

將測序正確的含有pGEX-4T-2/TAT-RhoGDI2重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α在在含100mg/l的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，當OD₆₀₀達到0.6時，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28℃誘導12h，異源表達GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種TAT-RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的分離純化TAT-RhoGDI2融合蛋白具體包括以下步驟：

a.利用GST標簽純化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白：

利用GST親和層析，帶有GST標簽的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白選擇性的吸附到谷胱甘肽純化柱上，純化獲得GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；

b.利用分子篩Sephadex?G200進一步分離純化GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白；

c.收集上步純化的GST/TAT-RhoGDI2融合蛋白，用thrombin酶切融合蛋白，去除GST標簽，將酶切反應液濃縮后進行GST親和層析去除GST標簽，穿出液含有TAT-RhoGDI2融合蛋白，Thrombin酶通過超濾除去。

9.一種如權(quán)利要求1～3任一所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白的應用，其特征在于，所述的TAT-RhoGDI2融合蛋白用于抑制膀胱癌T24細胞轉(zhuǎn)移。