[發(fā)明專利]鑒定龜甲的PCR特異引物及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410119005.6
• 申請日: 2014-03-28
• 公開（公告）號: CN104946729B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發(fā)明（設計）人: 黃璐琦;袁媛;蔣超;李曼
• 申請（專利權）人: 中國中醫(yī)科學院中藥研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 11245 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司
• 代理人: 關暢<國際申請>=<國際公布>=<進入國

本發(fā)明屬于中藥及中藥材鑒定技術領域，特別涉及到一種能夠特異鑒定龜甲的PCR特異引物及其檢測方法。使用此方法鑒別龜甲的真?zhèn)?，只通過簡單的DNA提取、PCR特異性擴增、熒光檢測即可完成對樣品真?zhèn)蔚蔫b別。具有操作簡單、特異性強、重復性好等優(yōu)點。主要用于龜甲藥材、含有龜甲的制劑以及龜甲活體材料的快速鑒定。

技術領域

本發(fā)明涉及中藥及中藥材鑒定技術領域，特別涉及一種能夠特異鑒定龜甲的PCR特異引物及其檢測方法。主要用于龜甲藥材、含有龜甲的制劑以及龜甲活體材料的快速鑒定。

背景技術

中藥材龜甲為龜科動物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲，具有滋陰潛陽，益腎強骨，養(yǎng)血補心，固經(jīng)止崩之功效。龜科動物種類眾多，近年來由于需求量迅猛增長，市場上出現(xiàn)了大量的龜甲混淆品，嚴重影響了龜甲的用藥安全。傳統(tǒng)鑒別龜甲的方法包括性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜法鑒別、光譜法鑒別、紫外光譜法鑒別等。但是傳統(tǒng)的檢測方法主要依賴于藥材中的化學成分，而化學成分又易受品種及產(chǎn)地的影響。分子標記技術已成功用于中藥鑒定，線粒體DNA的Cyt b(中藥材龜甲細胞色素b特異性鑒定研究，中國藥學雜志，2012，4(3)：182-185)和細胞色素C氧化酶亞基I(Cytochrome c oxidasesubunitI，CoI)，可以作為DNA標記鑒別龜甲(崔麗娜，杜鶴，孫佳明等，基于COI條形碼序列的龜甲及其混偽品的DNA分子鑒定[J].吉林中醫(yī)藥，2012，2)。劉中權等利用線粒體12SrRNA基因片段序列建立了龜甲及原動物的高特異性PCR鑒定方法(劉中權，王義權，周開亞等，中藥材龜甲及原動物的高特異性PCR鑒定研究，藥學學報，1999，12：941-945)，但目前市場上出現(xiàn)了一些新的外來種。李明成等公開了一種龜甲DNA檢測試劑盒及鑒定方法(申請?zhí)枺?01310178856.3)，其僅包括5種偽品。

本發(fā)明主要結合常規(guī)PCR和熒光檢測方法，在較短時間內(nèi)快速鑒定龜甲及其常見偽品，成本低、適用性好。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的PCR引物及方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種龜甲的PCR特異性引物及其檢測方法，該方法操作簡單、樣品量少、能快速準確的鑒定龜甲藥材、粉末制劑以及活體材料，特別適用于鑒定因加工而導致DNA含量極少、形態(tài)破碎的中藥真?zhèn)蔚蔫b定。

一種鑒定龜甲的特異引物F1、F2，其序列為：

F1：5′-TTTGGAAACTGACTTGTACCTTTAACG-3′

F2：5′-GAGTAGTAATAGGACGGCTGTAATAAGTAGA-3′。

一種龜甲的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟：

a)從所述材料中提取得到DNA樣品；

b)用權利要求1所述的引物進行PCR反應，PCR反應參數(shù)為95℃預變性5min后，進行30次循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95℃30s，55-65℃45s，后延伸72℃5min，獲得擴增產(chǎn)物；

c)電泳所述擴增產(chǎn)物，如果存在分子量360bp的單一DNA條帶，則確定所檢材料為龜甲；

d)直接在所述擴增產(chǎn)物中加入2μL20×SYBR Green I染料，振蕩30s充分混勻，于365nm紫外燈下檢測PCR產(chǎn)物；如果反應產(chǎn)物發(fā)出強烈綠色熒光，則確定所檢材料為龜甲。

本發(fā)明采用熒光檢測方法檢測PCR擴增產(chǎn)物，不需電泳使得檢測時間大大縮短，且僅需簡易紫外燈即可完成操作，不需要使用電泳設備和凝膠成像系統(tǒng)。

綜上所述，本發(fā)明提供了快速準確鑒定龜甲的PCR特異性引物及檢測方法，以龜甲DNA為模板，能將其從與其親緣關系極近的其他的龜類中，高效、準確地鑒定出來，為龜甲鑒定提供了一種實用的技術。

附圖說明