[發(fā)明專利]檢測細菌對氟苯尼考耐藥性的LAMP方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410118217.2
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103937883A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李軍;曾蕓;馮世文;楊威;陳澤祥;潘艷;劉麗婭;彭昊;許力干;馬春霞;胡帥;禤雄標;柳峰;謝永平;謝宇舟;鐘舒紅
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/18;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測細菌對氟苯尼考耐藥性（floR基因）的LAMP方法。?

背景技術(shù)

氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)F)是氯霉素的氟化衍生物，又名氟甲砜霉素，是由美國先靈葆雅公司的Nagabhushan研制的，主要用于治療動物細菌性疾病的一種抗菌藥物。氟苯尼考的抗菌機理主要是與細菌70S核蛋白體的50S亞基上的A位結(jié)合，阻礙肽酰基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，抑制肽鏈的延伸，從而抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。氟苯尼考因其具有抗菌譜廣、吸收良好、體內(nèi)分布廣以及無潛在再生障礙性貧血的副作用等優(yōu)點，在獸醫(yī)臨床上廣泛用于預(yù)防和治療動物細菌性疾病。氟苯尼考在1990年首次在日本上市；1993年挪威批準該藥可用于治療鮭的癤病；1995年法國、英國、奧地利、墨西哥及西班牙批準用于治療牛呼吸系統(tǒng)細菌性疾病；2000年我國通過了該藥的審批，系國家二類新獸藥，用于畜禽及水生動物的全身感染的治療，對呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染療效顯著。然而，氟苯尼考的長期和不當(dāng)使用已導(dǎo)致嚴重的耐藥問題。相關(guān)調(diào)查研究表明，細菌的耐藥機制越來越復(fù)雜，細菌產(chǎn)生耐藥性的速率遠遠超過新藥研發(fā)使用的速率，抗生素的持續(xù)不當(dāng)使用將有可能導(dǎo)致無藥可用的局面。因此，對氟苯尼考耐藥性的持續(xù)監(jiān)測以及近一步深入研究氟苯尼考耐藥的產(chǎn)生機制和傳播機制，將為臨床上科學(xué)使用氟苯尼考、減緩耐藥菌的產(chǎn)生提供有價值的參考。?

目前，細菌對氟苯尼考的耐藥性判定方法有以下兩種：一是測定氟苯尼考對菌株的MIC值，依據(jù)該值的大小進行判定；二是進行體外藥物敏感試驗測定抑菌圈大小來判定。這兩種檢測方法都要消耗大量的實驗耗材和進行繁瑣的實驗操作，費時費力，試驗結(jié)果主要是通過肉眼觀察來判定，增加了人為因素。?

細菌氟苯尼考耐藥基因floR編碼的蛋白是一種外輸泵蛋白，能特異性的將細菌體內(nèi)的氟苯尼考泵出體外，導(dǎo)致氟苯尼考無法發(fā)揮其抑制細菌蛋白質(zhì)合成的功能，失去其抑制或殺滅細菌的作用。目前對細菌氟苯尼考耐藥基因floR檢測使用常規(guī)的PCR方法，該法準確性較高，但需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，費時，成本高，靈敏度不夠高，特異性不夠強，擴增產(chǎn)物容易污染PCR儀，不適合流行病學(xué)調(diào)查中大批量檢測。?

LAMP方法具有靈敏性高、特異性好、反應(yīng)時間短、判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等?優(yōu)勢，目前多數(shù)建立的LAMP反應(yīng)方法多采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，只能分析LAMP反應(yīng)的最終結(jié)果，不能進行定量，且存在氣溶膠污染實驗室的危險，由于缺乏對反應(yīng)的實時監(jiān)控很難排除這些干擾因素，不能對檢測結(jié)果做出準確的判定。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種敏感度高、特異性強、快速準確的檢測細菌對氟苯尼考耐藥性的LAMP方法，以實現(xiàn)快速、實時、定量檢測細菌對氟苯尼考耐藥性（floR基因）。?

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：檢測細菌對氟苯尼考耐藥性的LAMP引物組，包括外引物對F3和B3、內(nèi)引物對FIP和BIP，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列。?

檢測細菌對氟苯尼考耐藥性的LAMP方法，利用LAMP引物組，在63℃恒溫反應(yīng)條件下，進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)60min；LAMP引物組包括外引物對F3和B3、內(nèi)引物對FIP和BIP，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列。?

擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系以25μL計，包括：2×Reaction?Mix12.5μL，Bst?DNA?Polymerase1μL，Primer?FIP40pmol、BIP40pmol、F35pmol、B35pmol，細菌質(zhì)粒DNA2μL，Distilled?Water補足25μL。?

擴增反應(yīng)在Loopamp實時濁度儀內(nèi)全程密閉監(jiān)控進行。?

擴增反應(yīng)后采用鈣黃綠素?zé)晒馊玖线M行熒光檢測，熒光染料在反應(yīng)前加入。?

氟苯尼考耐藥基因floR是細菌對氟苯尼考耐藥的標志性基因，通過測定氟苯尼考對細菌的MIC，以及對細菌floR基因進行定量，形成floR基因與MIC的關(guān)聯(lián)，通過LAMP方法快速測定floR基因的含量，即可判定細菌對氟苯尼考的耐藥性，這將為監(jiān)測氟苯尼考耐藥性提供極大的便利。?