[發(fā)明專利]一種強效降壓磷酸肽及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410118129.2
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103864896A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 隋少卉;董俊軍;蔣志剛;李建;吳為輝;蔣輝;劉基偉;張鳴;閻亮;劉斌
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍防化學(xué)院
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/22;C07K1/107;C07K1/06
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1.一種強效降壓磷酸肽及其制備方法，其特征在于所述的磷酸肽為磷酸肽1和磷酸肽2，其分別具有如下的氨基酸序列：

磷酸肽1：Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂

磷酸肽2：Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂。

磷酸肽1序列中的絲氨酸Ser被磷酸化修飾；

磷酸肽2序列中的絲氨酸Ser和酪氨酸Tyr均被磷酸化修飾。

2.如權(quán)利要求1所述的一種強效降壓磷酸肽的制備方法，其特征在于該方法步驟如下：

(1)帶有保護基的多肽片段的合成：先后用N，N-二甲基甲酰胺DMF、N，N-二甲基甲酰胺DCM∶氯甲烷＝1∶2的混合液浸泡RINK?AMIDE-MBHA樹脂，然后用20％哌啶/DMF溶液脫除樹脂上的Fmoc基團，接著在樹脂中加入羧基端的第一個氨基酸Fmoc-Met-OH，4倍Fmoc-Met-OH摩爾數(shù)的TBTU/HoBt/DIEA/DMF溶液，將第一個氨基酸耦合到樹脂上，用DMF、DCM、DMF各洗滌三遍，用kaiser’s試劑檢測反應(yīng)完全，再用20％哌啶/DMF脫除羧基端的第一個氨基酸Fmoc-Met-OH氨基的Fmoc保護，用DMF、DCM、DMF各洗滌三遍，用kaiser’s試劑檢測已脫除，之后依次加入Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH或Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Pyr-OH，按上述的耦合、洗滌、檢測、脫保護條件進行，從而使多肽鏈延長，直到最后一個氨基酸Boc-Pyr-OH連接上為止，形成連有樹脂的帶有保護基的多肽Pyr-Pro-Ser-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂或Pyr-Pro-Ser-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Tyr-Gly-Leu-Met-NH₂；

(2)磷酸化修飾：先用亞磷酰胺試劑二苯基N，N′-二異丙基亞磷酰胺在四氮唑催化下，將含有絲氨酸Ser、酪氨酸Tyr、蘇氨酸Thr中的一種或以上的多肽生成亞磷酸三酯，然后用氧化劑過氧化叔丁醇，將其氧化成相應(yīng)的磷酸三酯：連有樹脂的帶有保護基的多肽Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂或Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂；

(3)切除與沉淀：采用三氟乙酸切除溶液切除樹脂并選擇性地脫去保護基后，得到磷酸化的目標(biāo)產(chǎn)物：磷酸肽1Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-LysAsp(OtBu)-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂或磷酸肽2Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Tyr(PO₃H)-Gly-Leu-Met-NH₂，將上述切除液吹去溶劑后，用乙醚沉淀，得到磷酸肽粗品；

(4)磷酸肽純化：使用填裝有的二氧化鈦納米粒子的磷酸化多肽純化裝置，對磷酸肽1和磷酸肽2粗品進行分離純化；

(5)鑒定：用色譜、質(zhì)譜分析技術(shù)分析鑒定磷酸肽1和磷酸肽2。