[發(fā)明專利]一種林蛙皮膠原蛋白微粉的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410117658.0
• 申請(qǐng)日: 2014-03-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103882084A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張梅;王佳冕;鄧旭明;徐文宇;張俞靜;李雪琪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06;C07K14/78;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30
• 代理公司: 長(zhǎng)春吉大專利代理有限責(zé)任公司 22201
• 代理人: 王恩遠(yuǎn)

技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及膠原蛋白的制備方法，尤其是涉及一種林蛙皮膠原蛋白微粉的制備方法。?

背景技術(shù)：

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，是肌腱、軟骨、皮膚和血管的主要成分，占蛋白質(zhì)總量的25%～30%。膠原蛋白具有獨(dú)特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性。膠原蛋白在水、弱酸和弱堿中不降解，且在煮沸后變?yōu)榭扇艿膯捂溄Y(jié)構(gòu)的明膠，但由于膠原蛋白的分子量比明膠大，具有更高的生物活性，因此，膠原蛋白更適合生物組織利用，更易促進(jìn)受損組織再生，縮短愈合過(guò)程。?

由于瘋牛病和口蹄疫等動(dòng)物傳染性疾病全球肆虐，目前亟待尋找更高質(zhì)量和更高安全性的未變性天然膠原蛋白的提取原材料。眾所周知，水產(chǎn)動(dòng)物比陸生動(dòng)物在安全性上具有更大的優(yōu)勢(shì)，因此水產(chǎn)動(dòng)物已經(jīng)成為未變性天然膠原蛋白的優(yōu)選原材料，其中，林蛙因其天然安全性成為優(yōu)中之選。?

目前，在醫(yī)用無(wú)紡布和美容產(chǎn)品中，作為生物活性物質(zhì)添加的膠原蛋白粉，因提取原料較為復(fù)雜，難以保證安全性，且膠原蛋白粉顆粒體積較大，不易被人體皮膚吸收。?

發(fā)明內(nèi)容：本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，旨在提供一種以林蛙皮為原料，制備膠原蛋白微粉的方法。根據(jù)本方法制備的林蛙皮膠原蛋白微粉的粒徑范圍為200nm—3000nm，顆粒體積小且粒度均勻，安全無(wú)毒、易于被人體皮膚吸收。?

本發(fā)明為解決技術(shù)問(wèn)題而采用如下技術(shù)方案：?

1、一種林蛙皮膠原蛋白微粉的制備方法，其步驟如下：?

（1）林蛙皮膠原蛋白肽的制備?

①脫色：稱取干燥林蛙皮，用水浸泡至舒展變軟后，加入到0.05mol/L的NaOH水溶液和1%w/vH₂O₂水溶液的混合溶液中浸沒(méi)靜置其中NaOH水溶液與H₂O₂水溶液的體積比為1～3:1，攪拌，每2～4h更換一次混合溶液，直至溶液中無(wú)可見(jiàn)色素產(chǎn)生，將林蛙皮用蒸餾水清?洗，于25～45℃烘干；?

②脫脂：將烘干后的林蛙皮放入丙酮中浸沒(méi)靜置，恒溫25±10℃，攪拌2～3d，期間每3-4h更換一次丙酮，以蒸餾水洗去林蛙皮上的殘余脂肪；?

③酸酶提取：將脫脂、脫色處理后的林蛙皮放入0.5～1mol/L乙酸水溶液中，林蛙皮與乙酸水溶液的質(zhì)量體積比為1:100g/ml，并加入規(guī)格為3.000-3.500NFU/mg的胃蛋白酶，林蛙皮與胃蛋白酶的質(zhì)量比為20～100:1，置于35±10℃恒溫水浴中，攪拌24～96h，得林蛙皮的酸酶提取液；?

④乙二胺四乙酸滅酶活：向林蛙皮的酸酶提取液中加入乙二胺四乙酸，其中林蛙皮與乙二胺四乙酸質(zhì)量比為33～167:1，靜置1～10h；?

⑤離心：將靜置后的林蛙皮酸酶提取液離心10～30min，轉(zhuǎn)數(shù)為4000～10000r/min，合并收集上清液；?

⑥鹽析：向上述上清液中加入NaCl，使NaCl濃度為4～5mol/L，攪拌12～24h后，靜置12～24h，以轉(zhuǎn)數(shù)5000～10000r/min離心20～40min，除去上清液，取沉淀溶于三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，其中每1L緩沖溶液含有NaCl1mol和三羥甲基氨基甲烷0.1mol，并加入HCl調(diào)節(jié)PH值至7.2～7.6，且林蛙皮與緩沖溶液的質(zhì)量體積比1:20～50g/mL，向上述緩沖溶液加入NaCl，使NaCl的濃度為1.7～2.4mol/L，靜置12h，以轉(zhuǎn)數(shù)5000～10000r/min，離心30～60min，得沉淀；?

⑦透析：將上述沉淀溶于1%w/v乙酸水溶液中，且林蛙皮與乙酸水溶液的質(zhì)量體積比為1:10～50g/mL，將乙酸水溶液裝入透析袋中，再將透析袋浸入蒸餾水中透析3～7d，更換蒸餾水至其中無(wú)氯離子產(chǎn)生；?

⑧聚乙二醇20000濃縮：將上述透析袋埋到固體聚乙二醇20000中，更換浸濕的聚乙二醇20000，至透析袋中的溶液濃縮至原體積的1/2；?

⑨冷凍干燥：將上述濃縮后的溶液經(jīng)預(yù)凍后，放入凍干機(jī)中真空冷凍干燥，制得林蛙皮膠原蛋白肽；?

（2）林蛙皮膠原蛋白微粉的制備?

①取林蛙皮膠原蛋白肽制成濃度為0.05～0.10g/ml的醋酸溶液，攪拌12h；?

②調(diào)節(jié)靜電紡絲條件中的電壓至15～20V、紡絲距離10～15cm、紡絲速度1～2ml/h，電紡得林蛙皮膠原蛋白纖維膜，用砂紙將該纖維膜從錫箔打磨下來(lái)，收集得林蛙皮膠原蛋白微粉。?

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：?