[發明專利]與奶牛乳脂率性狀相關的分子標記及其應用

有效

• 申請號: 201410116914.4
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN103911374A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 俞英;董易春;王曉;劉超
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及動物分子標記領域，具體地說，涉及一種與奶牛乳脂率性狀相關的TRAPPC9基因作為分子標記的應用。

背景技術

乳脂是存在于乳汁中的一種天然的高質量脂肪，相比于其他脂肪，乳汁更易被人體消化吸收，其消化率可達98%。在牛奶生產中，乳脂在牛奶中的含量越高牛奶的營養價值也越高。目前，乳脂率是衡量牛奶品質的一個重要指標，其含量的高低直接關系到奶牛生產的經濟效益。

隨著分子遺傳學、分子生物學技術和數量遺傳學的發展，分子遺傳標記和標記輔助選擇被廣泛地應用到畜禽育種中，并取得了巨大的成就。Snapshot測序技術是一種基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術，也稱小測序，主要針對中等通量的SNP分型項目，其主要原理是將測序酶、四種熒光標記的ddNTP、緊鄰多態位點的延伸引物和PCR產物模板按一定體系混合，引物延伸一個堿基即終止，經測序儀檢測，根據峰的顏色可以得知參與反應的堿基種內，從而判斷樣本在該位點的基因型。該方法具有分型準確、通量高、不受SNP位點多態性特性限制和樣本個數限制等優點。

轉運蛋白顆粒復合體9(TRAPPC9,trafficking?protein?particle?complex9)基因是人常染色體隱性精神發育遲滯智力障礙相關的基因，其編碼的蛋白轉運蛋白顆粒復合體9參與內質網到高爾基體的囊泡轉移和神經細胞的分化，其編碼的蛋白也叫做NIBP（NIK?and?IKKβ-binding?protein），參與膜泡運輸過程，同時具有增強TNF-α活化NF-κB信號通路的功能。NF-κB是重要的核轉錄因子，參與調控大量基因表達，在細胞生存、增殖、分化和凋亡過程中發揮著重要的生物學功能。目前關于TRAPPC9基因多態性對乳脂率的影響還沒有報道。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種與奶牛乳脂率性狀相關的分子標記及其應用。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種與奶牛乳脂率性狀相關的分子標記，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示，在第204位有1個T204-G204堿基突變，導致奶牛乳脂率性狀出現多態性。

進一步地，所述堿基突變的位點位于TRAPPC9基因的第七內含子的57bp處。

本發明還提供了用于擴增所述分子標記的引物對，其核苷酸序列如下：

正向引物F：5’-TCTTCTCTTTTGACCCTACAG-3’；

反向引物R：5’-GGTTTCAAGTTCTGACTCCAG-3’。本發明還提供了前述分子標記在中國荷斯坦奶牛乳脂率標記輔助選擇中的應用。

進一步地，所述應用包括如下步驟：

1）取待檢測奶牛的基因組DNA；

2）以基因組DNA為模板，利用所述引物對進行PCR擴增，獲得中國荷斯坦奶牛TRAPPC9基因上274bp的目的片段；

3）利用SnaPshot技術檢測PCR產物，如果擴增產物序列中204bp處為T，則待測奶牛屬于乳脂率高的中國荷斯坦奶牛優勢品種。

其中，所述步驟2）中PCR反應體系為25μL，其中100ng/μL基因組DNA模板1μL，10pmol/μL引物F和R各1μL，12.5μL?Premix?TaqTM，9.5μL?ddH₂O。

其中，所述步驟2）中PCR反應條件為：95℃預變性10min；94℃變性30s，60℃復性30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸10min；降溫至4℃保持。

其中，所述步驟3）中利用SnaPshot技術檢測PCR產物，具體步驟為：取步驟2）獲得的PCR產物3ul用ExoI和FastAP純化，主要是用ExoI去除反應產物中的剩余引物，用FastAP去除反應中剩余的DNTP，純化后利用SNP分型延伸引物進行延伸，延伸之后上機進行測序。如果測序結果如圖1左圖所示，為TT型，則待測奶牛屬于高乳脂率的中國荷斯坦奶牛優勢個體，出現如圖1中圖和右圖所示，即TG或GG型，則為普通個體。

本發明通過對中國荷斯坦奶牛TRAPPC9基因的SNP位點進行基因分型，利用SAS9.1軟件的GLM過程把基因分型結果與奶牛的乳脂率進行關聯分析發現TT型個體的乳脂率極顯著高于GG型個體（P<0.05）。該位點的發現為進行分子育種提供了新的標記。

進一步地，所述SNP分型延伸引物的核苷酸序列為：

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTAGCAAAACCAGATGGACTTGTG-3’。