[發明專利]一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法

有效

• 申請號: 201410116362.7
• 申請日: 2014-03-27
• 公開（公告）號: CN103849639A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 許激揚;卞筱泓;劉榮;趙玉成;沃龍飛;張雪霞
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
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技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體地說，是關于一株提高半胱氨酸利用率的菌株高產谷胱甘肽的方法。

背景技術

谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)是細胞內重要的抗氧化劑和主要的非蛋白巰基化合物。在大部分動物、植物和微生物的細胞與組織中，谷胱甘肽以氧化型和還原型兩種形式存在，兩者通過谷胱甘肽還原酶保持動態平衡從而使還原型谷胱甘肽發揮有效的生化反應。例如：谷胱甘肽通過還原，共軛或與其他非酶抗氧化劑協同以發揮抗氧化作用，清除內生或外源的氧化物質和親電子體，維持內環境氧化還原穩態并起到細胞保護作用；作為輔酶參與氨基酸轉運與代謝(如γ-谷氨酰基循環)，保持抗壞血酸復位狀態并形成脫氧核糖核酸類物質和一些小分子化合物(如半胱氨酸，甘氨酸，谷氨酸)；此外，谷胱甘肽間接調控DNA的合成，從而調節細胞乃至組織的生長和死亡，進而對抗或誘發腫瘤，免疫缺陷，心血管疾病，肝腎疾病或神經性疾病。鑒于此，谷胱甘肽大量應用于醫藥保健，護膚美容，食品添加等行業。

目前GSH的生產方法主要有溶劑萃取法、化學合成法和生物酶催化法和生物發酵法。相比之下，生物發酵法具有反應條件溫和、反應步驟簡單、成本低、轉化效率高、生產速率快等優勢，是今后生產谷胱甘肽的主要趨勢，但目前大部分研究還停留在實驗室階段，實現商業化生產的國家主要是日本。

近年來基于發酵法對GSH產量提高的方法漸漸由傳統的育種策略，培養條件優化和控制轉向對代謝的調控和分子機制的研究，一些數理知識的引入在發酵條件優化，發酵過程控制及動力學模型的建立上起著重要作用，近來分子生物學的發展也為研究者從分子水平探究、提高GSH產量提供了新思路。L-半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前體氨基酸之一，細胞內L-半胱氨酸的供應不足嚴重影響了谷胱甘肽的合成速度及產量。因此可以采用分子生物學方法使L-半胱氨酸大量進入細胞，最終使細胞內谷胱甘肽的合成量增加。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒，以用于構建表達胱氨酸轉運系統底物結合蛋白的菌株。

本發明還有一個目的在于，提供一種胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒的構建方法。

本發明還有一個目的在于，提供一種胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒的應用。

本發明還有一個目的在于，提供一種過表達胱氨酸轉運系統底物結合蛋白生物合成谷胱甘肽的方法。

本發明提供的胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒包括胱氨酸轉運系統底物結合蛋白基因fliY序列和一個合適的載體片段；所述序列fliY如NCBI上Gene?ID為948833的序列所示。

根據本發明的一個優選實施例，在胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒中，fliY連接在一個合適的載體上，通過合適的誘導劑誘導，從而使fliY過量表達，進而使合成谷胱甘肽的前體氨基酸之一半胱氨酸可以大量的進入細胞，最終使細胞內谷胱甘肽的合成量增加。

根據本發明的另一個優選實施例，所述胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒包括一個卡那霉素抗性基因，用以篩選基因重組菌。

本發明提供的谷胱甘肽合成酶系重組質粒的構建方法包括以下步驟：

A)PCR擴增獲得fliY序列；

B)將fliY序列克隆入pET28a。

本發明提供的胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組質粒可用于構建表達胱氨酸轉運系統底物結合蛋白的菌株。

本發明提供的方法可用于合成谷胱甘肽。

本發明提供的合成谷胱甘肽的方法通過發酵培養本發明提供的胱氨酸轉運系統底物結合蛋白重組菌株，合成谷胱甘肽。

使用本發明提供的質粒可以構建合成谷胱甘肽大腸桿菌，可以明顯地提高半胱氨酸利用率，提高了谷胱甘肽生產量，降低了成本和能耗，可為進一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎模型。除此之外，該方法構建的菌株及思路可以用于其他因原料利用率低限制產量提高的目的產物，為生產有價值的產品提供了新的思路。

附圖說明

圖1是PCR擴增獲得的fliY的凝膠電泳檢測結果，其中泳道1為fliY。

圖2是BL21-fliY質粒雙酶切的凝膠檢測結果，其中泳道1中5350bp左右的條帶為質粒

pET-28a(+)的DNA片段，800bp左右的條帶為基因fliY的DNA片段。

圖3是質粒pET28a-fliY的結構示意圖。

具體實施方式