[發明專利]鑒別肝素中牛基因來源的熒光PCR檢測試劑及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410115327.3
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN103937881A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 李曄;全爽;金麗華
• 申請（專利權）人: 北京電子科技職業學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 李桂玲;許文娟

1.一種鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，包括一對引物和一條TaqMan探針，其特征在于，所述一對引物分別是SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列，所述TaqMan探針是SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列。

2.根據權利要求1中所述的鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，其特征在于，所述TaqMan探針SEQ?ID?NO.3的5’端連接有熒光報告基團，3’端連接有淬滅集團。

3.根據權利要求2中所述的鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，其特征在于，所述5’端連接的熒光報告集團為6-羧基熒光素，所述3’端連接的淬滅集團為6-羧基四甲基諾丹明。

4.一種如權利要求1所述的鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

1）選擇牛線粒體基因中特異和保守的Bov-A2基因的保守序列片段為靶目標，其基因片段的擴增目標核苷酸序列為SEQ?ID?NO.4；

2）根據牛特異和保守的線粒體基因保守序列的特點，應用Primer?Express3.0軟件和DNAStar中的PrimerSelect軟件，設計合成待測引物和探針；

3）引物和探針的合成使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；

4）探針合成同時進行兩端標記，探針5’端標記的熒光報告基團是FAM（6-羧基熒光素），3’端標記的淬滅基團是TAMRA（6-羧基四甲基諾丹明）；

5）將設計合成的引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，得到上述的引物和探針。

5.一種如權利要求1所述的鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑的應用，所述一種鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑可用于制備熒光定量PCR標準化試劑盒。

6.一種鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：

A.待檢測肝素的前處理

（1）將粉末狀肝素樣品0.03g加至滅菌離心管中，向管中加入1ml無酶水，

振蕩混勻，離心機3500rpm，30s，100℃水浴5min，放冷至室溫；

（2）槍頭反復吸取攪拌至樣品溶解，從溶解的樣品溶液中取10μl至一新的滅菌離心管中，再加入990μl無酶水，振蕩混勻，用1ml注射器使溶液通過45μm微孔濾膜過濾；

（3）從上一步得到的溶液中取45μl溶液，加入0.7μl試劑肝素酶，振蕩混勻，28℃水浴18h，得到待測肝素樣品；

B.熒光定量PCR

（1）PCR反應體系

熒光定量PCR采用25μl體積反應液，反應擴增體系與擴增條件按下述反應參數進行：

實時熒光定量PCR反應總體積為25μl，向反應管中加入下列組分，反應體系為：

MIX12.5μl上游引物F0.5μl下游引物R0.5μl探針6.5μl待測肝素樣品5μl

所述上游引物F和下游引物R分別是SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列，所述探針是SEQ?ID?NO.3所示的核苷酸序列；

（2）PCR擴增條件

實時熒光定量PCR的擴增條件為：

C.結果分析和判定

（1）結果分析條件設定

根據擴增曲線的熒光素種類，FAM代表牛源性成分，直接讀取檢測結果；基線和閾值設定原則根據儀器進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點為準；

（2）樣本檢測時均設立陰、陽性對照，檢測中兩種對照為有效擴增時，結果判斷標準如下：

Ct值大于40的樣本為陰性結果：Ct值大于38或無擴增曲線，表示樣品中無牛源性成分；

Ct值小于等于35的樣本為陽性結果：Ct值小于或等于35，且出現明顯的擴增曲線，表示樣品中存在牛源性成分。