[發明專利]鑒別肝素中牛基因來源的熒光PCR檢測試劑及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410115327.3
• 申請日: 2014-03-26
• 公開（公告）號: CN103937881A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 李曄;全爽;金麗華
• 申請（專利權）人: 北京電子科技職業學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 李桂玲;許文娟

技術領域

本發明涉及一種能鑒別肝素中牛基因來源的生物檢測試劑，以及這種試劑的制備方法和應用。

背景技術

肝素是一種抗凝劑，是由二種多糖交替連接而成的多聚體，在體內外都有抗凝血作用。臨床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手術、心臟導管檢查、體外循環、血液透析等。隨著藥理學及臨床醫學的進展，肝素的應用不斷擴大。

2010年我國肝素及其鹽的出口量創歷史新高，已躍居成為我國第一大西藥重點出口商品。2010年，我國肝素及其鹽共出口到51個國家和地區，出口集中度很高，前五大出口市場為法國、美國、德國、奧地利和意大利，所占出口比重累計高達86.32%。肝素原料藥可直接被用于制成標準肝素制劑，或進一步加工制成低分子肝素原料藥再制成低分子肝素制劑。標準肝素制劑和低分子肝素制劑可直接應用于臨床治療。肝素類產品主要包括肝素粗品、肝素原料藥、標準肝素制劑、低分子肝素原料藥以及低分子肝素制劑。

由于肝素類藥物主要是運用于心腦血管疾病和血液透析治療，其中在血液透析重癥治療中是唯一有效的特效藥物，其使用者集中于老齡和肥胖人群，主要消費市場分布集中在歐洲、美國和日本等發達國家。國際市場對肝素原料藥的需求十分強勁，主要是由于其下游產品肝素類藥物市場迅速擴容，并保持高速增長趨勢。預計到2015年，全球肝素類藥品的市場規模將達到79億美元，這意味著全球醫藥市場對肝素的需求仍將強勁增長。但是2008年的“肝素鈉事件”發生后全球肝素類藥物企業高度關注肝素鈉原料藥的質量，對通過FDA和CEP認證的肝素鈉原料藥需求量大幅增加，而那些不具備這項質量認證的企業今后將無法立足國際市場。因此，對于肝素鈉的質量檢測成為了一個熱點問題，新版藥典中對于肝素鈉的來源檢測做出了明確規定，原因如下：

肝素首先從肝臟發現而得名，它也存在于肺、血管壁、腸粘膜等組織中，是動物體內一種天然抗凝血物質。天然存在于肥大細胞，現在主要從牛肺或豬小腸粘膜提取。但是由于牛等反芻動物可能攜帶致病性朊蛋白，從而患傳染性海綿狀腦病（俗稱羊瘙癢病和瘋牛病）。人類可能被攜帶病毒的動物傳染而患新型克雅氏癥。由于牛海綿狀腦病以及其他動物病毒疾病的存在，豬來源的唯一性就成為了確保肝素安全性的一條關鍵要求。因此，為確保肝素供應鏈的安全，各國在肝素進口方面明確要求肝素原料藥不允許來自于牛，同時加大了對中國出口肝素產品的質量、來源等方面的質量要求和抽檢力度。故開發一種高效的檢測肝素來源的試劑及方法顯得尤為必要。

目前，粗品肝素中有害雜質的檢測方法主要有核磁共振、高效液相色譜等方法。隨著分子生物學技術的迅猛發展，PCR技術得到了快速發展。由于肝素在制備的過程中需要經過多次提取與純化，當中的DNA會受到影響而降解為許多小片段，如果檢測目的片段太大，可能在檢測中無法發現陽性片段。而受電泳檢測有效性的限制，一般PCR難以采納小片段目的產物。中國專利申請號200810123709.5由黃亞紅、侯亞義等人公開了一種通過巢式PCR的方法鑒定肝素中動物基因的來源。但一般的PCR方法需要對PCR產物進行凝膠電泳完成整個檢測，而且通過電泳條帶進行檢測靈敏度偏低，當樣品中基因濃度差異不大時，條帶亮度很難反應出差異，進而影響對肝素中牛基因有無的判斷。而且凝膠電泳檢測會延長整個檢測時間，拖延檢測進度。因此，這種方法存在著檢測靈敏度低、操作復雜等問題。中國專利申請號200910094768.9公開的鑒別反芻動物源性成分的熒光PCR檢測試劑及制備方法和應用的發明專利中，涉及了一種能同時鑒別包含牛、山羊及綿羊三種反芻動物品種的生物檢測試劑，以及這種試劑的制備方法和應用。但此體系并不適用于肝素中牛基因的檢測，主要原因可以歸納為以下三點：1）經多人的研究結果表明，肝素多糖對于PCR擴增酶有抑制作用，不能直接用于real-time?PCR實驗，必須經過一定的處理才可行；2）此專利中方法較為復雜，多重PCR不利于肝素中牛基因的檢測；3）此外這種方法的反應體系為50μl，對試劑的消耗較大，大大提高了檢測成本，不利于實現企業規模化檢測。

發明內容

本發明提供了一種能鑒別檢測肝素粗制樣品的來源組成（牛基因）的熒光定量PCR檢測試劑，及其制備方法和應用。本發明利用TaqMan熒光定量PCR方法克服了普通PCR的不足之處，是檢測肝素原料藥中的反芻動物基因的最佳方法，具有靈敏度高、線性范圍廣、分析時間短、操作簡便、重復性好、結果直觀等特點。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：