[發明專利]一種磷酸化蛋白質組樣品快速處理方法

有效

• 申請號: 201410114497.X
• 申請日: 2014-03-25
• 公開（公告）號: CN104949864B
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 鄒漢法;劉芳潔;葉明亮
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 馬馳

1.一種磷酸化蛋白質組樣品快速處理方法，其特征在于：

具體步驟如下：

（1）將數量為10 000-500 000個的 HeLa細胞樣品加入50-100 μL反應體系內；

（2）將上述步驟（1）得到的反應體系加入胰蛋白酶后在振蕩器上渦旋震蕩至全部細胞膜破碎，所述反應體系中的胰蛋白酶的濃度為250 ng/μL-1.0 μg/μL；

（3）將上述步驟（2）中得到的混合物溶液放置于30-40 ℃水浴超聲器內超聲孵育；超聲孵育反應時間為25 min-1 h；

（4）將上述步驟（3）中超聲孵育后的混合液在通過離心機控制的、且填充了800 μg-2 mg 固定化金屬鈦離子親和色譜材料的GELoader Tip槍頭內進行磷酸肽富集，將所得磷酸化肽段放入凍干機凍干；得處理后的磷酸化蛋白質組樣品。

2.根據權利要求1所述的磷酸化蛋白質組樣品快速處理方法，其特征在于：將上述步驟（4）中得到的磷酸化肽段復溶在100 μL 0.1%體積濃度的甲酸中進行RP LC-MS/MS分析。

3.根據權利要求1所述的磷酸化蛋白質組樣品快速處理方法，其特征在于：步驟（1）中所述的反應體系是細胞裂解-蛋白酶解的反應體系，細胞裂解-蛋白酶解的反應體系是含有0.5%-1.0% 體積分數乙基苯基聚乙二醇，5-10 mM 二硫蘇糖醇和磷酸酶抑制劑的50-100 mM Tris-HCl緩沖溶液。

4.根據權利要求3所述的磷酸化蛋白質組樣品快速處理方法，其特征在于：所述反應體系中的磷酸酶抑制劑組成為0.5-1.5 mM 氟化鈉和0.5-1.5 mM 正釩酸鈉，pH為7.8-8.5。

5.根據權利要求1所述的磷酸化蛋白質組樣品快速處理方法，其特征在于：步驟（4）離心機的離心力為1000 g-3000 g，所述凍干機設置溫度為室溫。

6.根據權利要求1所述的磷酸化蛋白質組樣品快速處理方法，其特征在于：所采用的富集方式是將Ti-IMAC富集材料填充至GELoader Tip槍頭內，借用1000 g-3000 g離心力進行富集。

7.根據權利要求1所述的磷酸化蛋白質組樣品快速處理方法，其特征在于：將該樣品處理方法應用于磷酸化蛋白質組學快速分析，可獲取相應的磷酸肽和磷酸化位點的鑒定結果，該結果可以用于翻譯后修飾蛋白質組學分析。