[發(fā)明專(zhuān)利]一種磷酸化蛋白質(zhì)組樣品快速處理方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410114497.X
• 申請(qǐng)日: 2014-03-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104949864B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒漢法;劉芳潔;葉明亮
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類(lèi)號(hào): G01N1/28
• 分類(lèi)號(hào): G01N1/28
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司21002
• 代理人: 馬馳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)研究方向磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組樣品處理方法。

背景技術(shù)

迄今為止，蛋白質(zhì)磷酸化被發(fā)現(xiàn)是一種普遍發(fā)生的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它調(diào)控著大約30%的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)組。作為一種重要的翻譯后修飾，可逆的蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，例如細(xì)胞分化，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和信號(hào)傳導(dǎo)等。各種各樣的胞內(nèi)、胞外刺激都會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平的非正常變化，而這恰恰是許許多多人類(lèi)疾病發(fā)生的誘因。因此，為了系統(tǒng)性地理解復(fù)雜多變的細(xì)胞行為，深入的研究磷酸化蛋白質(zhì)組已經(jīng)成為了關(guān)鍵任務(wù)。最近，質(zhì)譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用上的快速發(fā)展使得其已經(jīng)成為了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具，僅僅單次的質(zhì)譜鑒定分析就可以獲得20,000多磷酸化位點(diǎn)的信息。

對(duì)于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究而言，樣品處理階段是關(guān)乎下游質(zhì)譜鑒定成功與否的重要步驟。常用的樣品處理方法的基本流程主要包括以下幾步：細(xì)胞裂解，蛋白質(zhì)提取（包括可選的蛋白沉淀），蛋白質(zhì)酶解和磷酸肽的富集（文獻(xiàn)1.Albuquerque,C.P.et al.A Multidimensional Chromatography Technology for In-depth Phosphoproteome Analysis.Mol.Cell.Proteomics7,1389-1396(2008).文獻(xiàn)2.Zhou,H.;Ye,M.et al.Robust phosphoproteome enrichment using monodisperse microsphere–based immobilized titanium(IV)ion affinity chromatography.Nat.Protoc.8,461-480(2013).）。如上步驟通常都是需要各自獨(dú)立完成，這就勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致樣品處理階段繁瑣費(fèi)力和低通量。因此，很有必要發(fā)展一種快速高效的樣品處理方法，以適用磷酸化蛋白組學(xué)的快速分析。

許多研究都在致力于優(yōu)化樣品的前處理階段，以適應(yīng)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的要求，與此同時(shí)，這些年來(lái)，大多數(shù)的研究多關(guān)注的是較費(fèi)時(shí)的蛋白酶解階段。高壓、超聲、微波、固定化酶和表面活性劑均被用來(lái)加速蛋白質(zhì)的酶解（文獻(xiàn)3.Olszowy,P.P.,Burns,A.&Ciborowski,P.S.Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.Anal.Biochem.438,67-72(2013).文獻(xiàn)4.López-Ferrer,D.et al.Ultra Fast Trypsin Digestion of Proteins by High Intensity Focused Ultrasound.J.Proteome Res.4,1569-1574(2005).文獻(xiàn)5.J.et al.Fast-Response Proteomics by Accelerated In-Gel Digestion of Proteins.Anal.Chem.75,1300-1306(2003).文獻(xiàn)6.Reddy,P.M.et al.Digestion Completeness of Microwave-Assisted and Conventional Trypsin-Catalyzed Reactions.J.Am.Soc.Mass Spectrom.21,421-424(2010).文獻(xiàn)7.Dycka,F.et al.Rapid and efficient protein enzymatic digestion:An experimental comparison.J.Electrophoresis33,288-295(2012).文獻(xiàn)8.Yu,Y.-Q.et al.Enzyme-Friendly,Mass Spectrometry-Compatible Surfactant for In-Solution Enzymatic Digestion of Proteins.Anal.Chem.75,6023-6028(2003).）。在眾多的技術(shù)中，借助于高濃度的酶無(wú)疑是一種很直接的用來(lái)縮短酶解時(shí)間的手段。曾有研究指出，使用越高比例的酶/蛋白比，蛋白水解的速度就會(huì)越高（文獻(xiàn)9.Hustoft,H.K.et al.Critical assessment of accelerating trypsination methods.J.Pharm.Biomed.Anal.56,1069-1078(2011).）。但是，令人不甚滿意的是，同樣，較多的自酶解肽段也會(huì)隨之產(chǎn)生，這就給后續(xù)的質(zhì)譜鑒定造成一定的困擾。因此，為了避免胰酶自酶解現(xiàn)象的干擾，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，通常推薦使用酶/蛋白比例為1/25，這就意味著酶解時(shí)間勢(shì)必要加長(zhǎng)至過(guò)夜酶解，以彌補(bǔ)酶解效率過(guò)低造成的酶解不足現(xiàn)象。但是，固定化酶的使用卻可以大大降低胰酶的自酶解程度，從而解決這一難題（文獻(xiàn)10.Sun,L.et al.Coupling Methanol Denaturation,Immobilized Trypsin Digestion,and Accurate Mass and Time Tagging for Liquid-Chromatography-Based Shotgun Proteomics of Low Nanogram Amounts of RAW264.7Cell Lysate.Anal.Chem.84,8715-8721(2012).文獻(xiàn)11.Li,D.et al.Functionalization Strategies for Protease Immobilization on Magnetic Nanoparticles.Adv.Funct.Mater.20,1767-1777(2010).）。由此可以發(fā)現(xiàn)，借由高濃度酶促進(jìn)蛋白酶解這一方法存在一定的可能性。盡管如此，固定化酶的使用仍然沒(méi)有趨于普遍化，這極有可能是因?yàn)椴僮鞯牟槐憷砸约肮潭ɑ副砻孑^高的非特異性吸附性能。而在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，必備的磷酸肽富集這一步驟的存在，使得高濃度胰蛋白酶促進(jìn)蛋白快速酶解這一思路成為可能。本發(fā)明首次利用該思路，借助于高濃度的胰蛋白酶，將繁瑣的樣品處理過(guò)程中的細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)酶解綜合于一體，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞裂解和蛋白酶解的相互促進(jìn)，從而保證快速、高效、高通量的實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的預(yù)處理。