[發明專利]人表皮干細胞的分離與培養方法

無效

• 申請號: 201410112277.3
• 申請日: 2014-03-25
• 公開（公告）號: CN103865872A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 詹日興;羅高興;吳軍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明屬于病理學技術領域，具體涉及人表皮干細胞的分離與培養方法。

背景技術

皮膚是人體最大的組織器官，覆蓋于人體的外表，具有抵御微生物入侵、防止紫外線輻射及水分丟失、調節體溫，維持外貌等重要功能，是燒傷、創傷外科研究的主要內容。正常皮膚的自我更新及受損皮膚的修復是由多種類型的于細胞共同作用的結果，是維持正常的組織結構和細胞內環境穩定的基本要求。在燒、創傷方面，表皮干細胞擁有無可質疑的潛能，它是皮膚組織特異性干細胞，在維持表皮自我更新、保持皮膚正常的表皮結構與功能及創面修復和皮膚重建方面起著重要作用。然而，體外培養表皮干細胞卻遲遲不能應用到臨床。傳統人表皮干細胞培養方法因需與3T3滋養細胞共培養以及需添加血清，方法復雜、條件較難一致、穩定性差、細胞分化快，一般只能傳到3-5代細胞擴增數量有限；因有滋養細胞影響，也無法應用到臨床上。

發明內容

本發明要解決的技術問題是為人表皮干細胞的分離與培養提供一種新選擇。

本發明的技術方案是人表皮干細胞的分離與培養方法，包括如下步驟：

a、消毒：將包皮環切術取下的人包皮組織用0.5%碘伏浸泡1～2min，PBS（磷酸緩沖液）漂洗至肉眼觀察不再有碘伏著色；

b、分離表皮與真皮：修剪掉皮下脂肪組織，組織修剪為約為0.5cm×1cm大小的皮片；加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆蓋組織塊，4℃消化l2～16h；棄中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS（磷酸緩沖液）清洗后用眼科鑷子分離表皮與真皮，得到表皮組織；

c、收集：剪碎表皮組織，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化5～10min，終止消化，過濾，離心，PBS洗滌，收集細胞；

d、培養：用K-SFM培養液將收集的細胞制成2.5×10⁵個/mL的單細胞懸液，接種單細胞懸液于包被了IV型膠原的培養器皿中，37℃靜置10min；棄未貼壁細胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培養液；37℃、5%CO₂培養；次日更換細胞培養液，繼續培養，每2天換液1次；

e、傳代：待細胞生長密度為70～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，終止消化，離心，收集細胞，按細胞接種面積擴大4～6倍傳代；

上述所有操作均在無菌條件下進行。

其中，步驟b中所述的0.25%的中性蛋白酶Ⅱ的配置方法為，0.5g中性蛋白酶Ⅱ溶入100mL0.1MPBS中，攪拌溶解，過濾，-20℃保存。

其中，步驟d中所述的K-SFM培養液包含下述成分：重組人表皮生長因子rEGF0.1～0.2ng/mL，牛垂體提取物BPE20～30μg/mL；CaCl₂0.05mM；青霉素、鏈酶素均為100U/mL。

其中，步驟d中所述的包被了IV型膠原的培養器皿采用如下方法制備：按照10μg/cm²計算，將適量0.lmg/mL的IV型膠原溶液加入細胞培養器皿中，是液體充分覆蓋培養器皿的培養面，4℃放置約12～24小時，使用前采用PBS清洗。

其中，步驟e中進行消化前去掉原培養液，并用PBS清洗細胞。

其中，步驟e中消化是指在37℃、5%CO₂下培養6～10分鐘。

其中，所述的終止消化采用含10%小牛血清的RPMI1640培養基。

其中，所述的離心為1000rpm/min條件下離心5min。

本發明的有益效果：本發明方法具有快速、高效、方法簡便、細胞活性高、細胞干性強等特點。采用本發明方法培養人表皮干細胞至少能傳到8代，極大提高了細胞擴增倍數；且分化控制好、細胞成分單一，因而具備了應用到臨床上的基本條件。

附圖說明

圖1為分離培養人表皮干細胞細胞生長形態示意圖；a為接種細胞后第一天貼壁細胞形態200倍；b為培養7天后小細胞克隆散在分布圖片200倍；c為12～14天細胞克隆融合后圖片200倍；d為高倍鏡下細胞形態400倍。

圖2為第8代分離培養人表皮干細胞細胞生長形態示意圖。

圖3為蛋白質印跡法檢測表皮干細胞標志物CK19及β1整合素的表達示意圖。

圖4為激光共聚焦顯微鏡觀察分離培養細胞中β1整合素和ck19的表達示意圖；C圖為A圖和B圖的融合；F圖為D圖和E圖的融合。

圖5為流式細胞儀檢測分離培養細胞表皮干細胞標準物α6-integrin及CD71的表達示意圖。

圖6為克隆形成實驗檢測表皮干細胞克隆形成能力示意圖。

具體實施方式