[發明專利]人表皮干細胞的分離與培養方法

無效

• 申請號: 201410112277.3
• 申請日: 2014-03-25
• 公開（公告）號: CN103865872A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 詹日興;羅高興;吳軍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

1.人表皮干細胞的分離與培養方法，其特征在于：包括如下步驟：

a、消毒：將包皮環切術取下的人包皮組織用0.5%碘伏浸泡1～2min，PBS漂洗至肉眼觀察不再有碘伏著色；

b、分離表皮與真皮：修剪掉皮下脂肪組織，組織修剪為約為0.5cm×1cm大小的皮片；加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆蓋組織塊，4℃消化l2～16h；棄中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS清洗后用眼科鑷子分離表皮與真皮，得到表皮組織；

c、收集：剪碎表皮組織，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化5～10min，終止消化，過濾，離心，PBS洗滌，收集細胞；

d、培養：用K-SFM培養液將收集的細胞制成2.5×10⁵個/mL的單細胞懸液，接種單細胞懸液于包被了IV型膠原的培養器皿中，37℃靜置10min；棄未貼壁細胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培養液；37℃、5%CO₂培養；次日更換細胞培養液，繼續培養，每2天換液1次；

e、傳代：待細胞生長密度為70～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，終止消化，離心，收集細胞，按細胞接種面積擴大4～6倍傳代；

上述所有操作均在無菌條件下進行。

2.如權利要求1所述的人表皮干細胞的分離與培養方法，其特征在于：步驟b中所述的0.25%的中性蛋白酶Ⅱ的配置方法為，0.5g中性蛋白酶Ⅱ溶入100mL0.1MPBS中，攪拌溶解，過濾，-20℃保存。

3.如權利要求1或2所述的人表皮干細胞的分離與培養方法，其特征在于：步驟c中所述的消化是指：步驟d中所述的K-SFM培養液包含下述成分：重組人表皮生長因子rEGF0.1～0.2ng/mL，牛垂體提取物BPE20～30μg/mL；CaCl₂0.05mM；青霉素、鏈酶素均為100U/mL。

4.如權利要求1～3任一項所述的人表皮干細胞的分離與培養方法，其特征在于：步驟d中所述的包被了IV型膠原的培養器皿采用如下方法制備：按照10μg/cm²計算，將適量0.lmg/mL的IV型膠原溶液加入細胞培養器皿中，是液體充分覆蓋培養器皿的培養面，4℃放置約12～24小時，使用前采用PBS清洗。

5.如權利要求1～4任一項所述的人表皮干細胞的分離與培養方法，其特征在于：步驟e中進行消化前去掉原培養液，并用PBS清洗細胞。

6.如權利要求1～5任一項所述的人表皮干細胞的分離與培養方法，其特征在于：步驟e中消化是指在37℃、5%CO₂下培養6～10分鐘。

7.如權利要求1～6任一項所述的人表皮干細胞的分離與培養方法，其特征在于：所述的終止消化采用含10%小牛血清的RPMI1640培養基。

8.如權利要求1所述的人表皮干細胞的分離與培養方法，其特征在于：所述的離心為1000rpm/min條件下離心5min。