[發明專利]提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉化率的方法

有效

• 申請號: 201410111544.5
• 申請日: 2014-03-24
• 公開（公告）號: CN103820489A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 張可煒;陳修貴;張舉仁
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發明涉及一種提高外源基因轉化率的方法，尤其涉及一種提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉化率的方法；屬植物基因工程領域。

背景技術

自1987年Umbeck等（Umbeck?et?al.Bio/Technology,1987,5:263-266）通過農桿菌介導法成功獲得珂字棉轉基因植株后，農桿菌介導法逐漸成為國際上最普遍的轉化手段之一，并取得了很大進展（Wu?et?al,2005,Plant?Breeding,124(2):142-146；Guo?et?al.Biologia?Plantarum.2007,51(2):242-248）。到目前為止，發表有關棉花遺傳轉化的文章也為數不多。主要原因是進行轉基因后棉花愈傷組織一般比較難以再生，棉花體細胞胚胎發生和植株再生的組織培養時間較長。從已有的報道來看，利用最適宜的基因型棉花品種進行遺傳轉化也需要8～10個月（Umbeck?et?al，Bio/Technology,1987,5:263-266）。此外，長時間離體培養獲得的再生植株往往存在比較嚴重的遺傳變異。一些學者試圖利用基因槍直接轉化棉花莖尖細胞，但轉化效率極低（McCabe?et?al.Bio/Technology,1993,11:596-598;Zapata?et?al.Theor.Appl.Genet.,1999,98:252-256）；還有一些學者利用基因槍轟擊棉花細胞懸浮細胞系（Fine?et?al.Plant?Cell?Rep.1990,8:586-589；Rajasekaran?et?al.Plant?Cell?Rep.2000,19:539-545），但建立棉花細胞懸浮系受基因型限制。珂字棉312(Coker312G)、珂字棉201(Coker201)目前發展成為眾多實驗室棉花轉基因的模式品種，但是珂字棉312和珂字棉201都是美國生產上過時的棉花品種，所獲得的轉基因棉花材料通常要經過雜交選育和系統選育才能在生產上應用，費時費力。因此，建立適宜的棉花遺傳轉化技術仍然是棉花基因工程研究的重要基礎。

植株再生困難、基因型依賴性強、轉化周期長及效率低是目前制約棉花遺傳轉化的主要因素。實驗室選用黃化小苗的莖尖為受體進行遺傳轉化，避免了植株再生過程，克服了基因型限制建立了一個新的棉花遺傳轉化體系（呂素蓮等，高技術通訊，2004，11:20-25）。但由于影響棉花黃化小苗莖尖轉化體系的因素較多，在實際應用中存在轉化率不穩定、重復性差的缺點，故提高棉花黃化小苗莖尖轉化體系的轉化率穩定性、重復性是急需解決的問題。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是進一步提高利用棉花黃化幼苗莖尖分生組織進行遺傳轉化的效率和重復性，提供一種有效提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉化率的方法。

本發明所述提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉化率的方法，步驟如下：

a)棉花黃化幼苗的培養，獲得轉基因受體植株;

棉花種子經硫酸脫絨后，用70%乙醇浸泡0.5～1.5min、0.1%的升汞浸泡10～15min，然后用無菌水洗滌3～5遍；消毒后種子放入鋪有三層濾紙的無菌瓶中，加入適量無菌水，于25～28℃溫箱中暗處萌發；2～3天后當下胚軸長到1～2cm后轉入pH5.8～6.0的CoM固體培養基中，置暗處在25～28℃、相對濕度40～60%條件下生長至株高為8～10cm的黃化幼苗，用于莖尖轉化；

其中，上述CoM固體培養基是指在CoM培養液中添加了質量百分比為6%的瓊脂而制得的培養基；CoM培養液是指用蒸餾水配制的含表1所述溶質的培養液。

表1、CoM培養液的溶質成分