[發(fā)明專(zhuān)利]提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉(zhuǎn)化率的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410111544.5
• 申請(qǐng)日: 2014-03-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103820489A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張可煒;陳修貴;張舉仁
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/82
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉(zhuǎn)化率的方法，步驟如下：

a)棉花種子滅菌后于培養(yǎng)箱中暗處萌發(fā)，當(dāng)下胚軸長(zhǎng)到1～2cm后轉(zhuǎn)入CoM固體培養(yǎng)基中，置暗處生長(zhǎng)至株高為8～10cm的黃化幼苗，用于莖尖轉(zhuǎn)化；

b)去掉黃化幼苗的種皮和一片子葉裸露出莖尖分生組織，然后劃傷莖尖頂端；

c)用脫脂棉球蘸吸浸染液，并將其放置在劃傷后的黃化幼苗莖尖頂端部位，在負(fù)壓條件下實(shí)施浸染；

d)將浸染后的黃化幼苗于25～28℃，暗培養(yǎng)3±0.5天，然后光培養(yǎng)2～3天；

e)將培養(yǎng)后黃花幼苗移栽入花盆，在溫度25～28℃、濕度40～60%條件下培養(yǎng)，至生長(zhǎng)出2～3片真葉；

f)用脫脂棉球蘸吸選擇劑，并將其放置在已長(zhǎng)出2～3片真葉的轉(zhuǎn)化苗莖尖頂端部位，實(shí)施抗性篩選，獲得抗性植株；

其特征在于：

所述劃傷莖尖的方法是：對(duì)莖尖頂端的分生組織作“十”字形或“米”字形劃傷，并控制劃傷傷口的深度為0.6～1.0mm；

所述實(shí)施浸染的方法是：在真空負(fù)壓為0.05～0.06MPa條件下，用吸有浸染液的脫脂棉球置于劃傷后的黃化幼苗莖尖頂端部位，在溫度25～28℃、空氣相對(duì)濕度40～60%的條件下浸染10～15min；其中，所述浸染液組成是：在CoM培養(yǎng)液基礎(chǔ)上添加了100～200mg/L的乙酰丁香酮和質(zhì)量百分比濃度為0.01～0.02%的表面活性劑Silwet-L77，以及含有重組外源基因的菌體濃度為OD₆₀₀=0.6～0.8的農(nóng)桿菌，所述浸染液pH為5.8～6.0；

所述選擇劑為除草劑，所述實(shí)施抗性篩選的方法是：在日溫25～28℃、夜溫20～22℃、相對(duì)濕度40～60%條件下，用吸有選擇劑的脫脂棉球置于轉(zhuǎn)化苗莖尖頂端部位12～24h，10～15d后觀察植株芽尖頂端分生組織的存活情況選出抗性植株，轉(zhuǎn)基因植株莖端生長(zhǎng)點(diǎn)保持綠色，生長(zhǎng)良好，非轉(zhuǎn)化植株生長(zhǎng)點(diǎn)發(fā)黑死亡。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于：所述劃傷傷口的深度為0.6～0.8mm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于：所述浸染時(shí)間10～12min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于：所述除草劑是氯磺隆。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述提高棉花黃化幼苗莖尖分生組織外源基因轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于：所述氯磺隆濃度是20～40mg/L。