[發明專利]核酸適配體及其衍生物、篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201410111108.8
• 申請日: 2014-03-24
• 公開（公告）號: CN103911379B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 王柯敏;譚譽宇;郭秋平;羊小海;何曉曉
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/68
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所(普通合伙)43008
• 代理人: 趙洪

技術領域

本發明涉及一種用于檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞的核酸適配體及其衍生物、篩選方法和應用。

背景技術

人鼻咽癌為我國最常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響人類健康，由于鼻咽部位較深且位置隱蔽，以致鼻咽癌早期癥狀和體征不明顯，容易漏診、誤診，延誤最佳治療時機，早期診斷鼻咽癌，可有效提高治療的效果和患者生存率。

鼻咽癌早期診斷的現狀及進展，《醫療診斷》，2011,1,7-12，介紹了鼻咽癌早期診斷的技術手段，比如免疫PCR（IPCR）方法。Paramita等采用的兩步EBV-IgA?ELIAS法，相對于免疫印記法，靈敏性和特異性分別從85.4%和90.1%上升到96.7%和98%，陽性預測值和陰性預測值分別從78.7%和97.3%增加到93.7%和97.5%。tong等構建了一個從混合鼻咽癌組織來源的cDNA文庫，并從鼻咽癌患者和健康人群血清中分離出31種腫瘤相關蛋白，表明血清中抗腫瘤相關抗原的自身抗體可用于鼻咽癌早期篩查診斷等等。但是利用蛋白抗體等的方法，親和力和特異性不夠理想，具有免疫原性，生產成本高，不利于保藏。

SELEX法篩選鼻咽癌核酸適配子的研究，山東醫藥2012年第52卷第23期，介紹了利用SELEX法篩選鼻咽癌核酸適配子，引物序列如下：上游引物（B1）序列：5’-FITC-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’，下游引物（B2）序列：5’-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’。鼻咽癌細胞株為EB病毒陽性低分化鼻咽癌細胞株（C666），采用傳統的SELEX法經過10輪循環篩選初步建立了鼻咽癌適配體庫，但是此研究僅僅停留在對部分核酸適配體進行序列同源性分析上，并未對單個核酸適配體的親和力和特異性進行研究，還需進一步研究才有可能得到性質優良的核酸適配體，不利于核酸適配體的后續應用。因此，開展鼻咽癌細胞核酸適配體篩選的相關工作，獲得具體的高親和力、高特異性地識別鼻咽癌細胞的核酸適配體是很有必要的。

Aptamers?from?Cell-Based?Selection?for?Bioanalytical?Applications，Chemical?Reviews，2013,113,2842-2862，作者介紹了針對細胞核酸適配體的篩選，一般需要20輪左右的篩選，才能獲得高親和力的核酸適配體。由此可見，傳統的cell-SELEX方法周期長，勞動量大，成本高。迫切需要發展高效快速的細胞核酸適配體的方法，以滿足日益增長的科學、醫療需求。

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種親和力強、特異性高、無免疫原性的檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞的核酸適配體，還提供一種效率高，可有效減少篩選循環次數的核酸適配體的篩選方法，還提供所述核酸適配體在檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞中的應用，還提供所述核酸適配體在制備檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞的試劑盒中的應用。

為解決上述技術問題，本發明提供一種用于檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞的核酸適配體，所述核酸適配體序列為

a：5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，所述X為

5’-TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGG-3’、

5’-TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3’或

5’-TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3’；

上述3個序列表示為，Seq?ID?NO:1：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，Seq?ID?NO:2：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGACCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，Seq?ID?NO:3：

5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’。

b：與a所述核酸適配體具有60%以上同源性且具有檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞功能；

c：在嚴緊條件下，與a或b的序列進行雜交的序列；或