[發明專利]核酸適配體及其衍生物、篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201410111108.8
• 申請日: 2014-03-24
• 公開（公告）號: CN103911379B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 王柯敏;譚譽宇;郭秋平;羊小海;何曉曉
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/68
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所(普通合伙)43008
• 代理人: 趙洪

1.一種核酸適配體，其特征是，所述核酸適配體為

a：5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，

所述X為5’-TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGG-3’、

5’-TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3’或

5’-TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3’；

b：與a所述核酸適配體具有60%以上同源性且具有檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞功能；

c：在嚴緊條件下，與a或b的序列進行雜交的序列；或

d：a、b或c的核酸適配體序列轉錄的RNA序列。

2.如權利要求1所述的核酸適配體，其特征是，所述核酸適配體在保持整體結構不變的前提下，所述核酸適配體的核苷酸序列上的任一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。

3.一種核酸適配體衍生物，其特征是，所述核酸適配體衍生物為如權利要求1或2的所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯衍生物或核酸適配體的相對應的肽核酸。

4.一種如權利要求1或2的核酸適配體的篩選方法，其特征是，包括以下步驟，

1、合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物：

隨機單鏈DNA文

庫:5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，

5’端引物：5’-FAM-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’，

3’端引物：5’-Biotin-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3’，和

鏈酶親和素修飾的瓊脂糖微球；

2、cell-SELEX篩選

2.1使無關序列和人鼻咽癌細胞株CNE2細胞接觸，得到預處理后的人鼻咽癌細胞株CNE2細胞；

2.2使隨機單鏈DNA文庫和預處理后的人鼻咽癌細胞株CNE2細胞接觸，孵育，得到處理后的人鼻咽癌細胞株CNE2細胞；

2.3將上述步驟2.2得到的處理后的人鼻咽癌細胞株CNE2細胞和單壁碳納米管接觸，篩選，得到CNE2細胞的特異核酸適配體文庫；

3、對步驟2的CNE2細胞的特異核酸適配體文庫進行PCR擴增，得到擴增的雙鏈DNA；

4、將步驟3的擴增的雙鏈DNA和鏈酶親和素修飾的瓊脂糖微球接觸，孵育，分離，變性處理，分離，得到單鏈DNA文庫；

5、陰性篩選：使無關序列和人鼻咽癌細胞株HONE細胞接觸，得到處理后的人鼻咽癌細胞株HONE細胞；將步驟4得到的單鏈DNA文庫和處理后的人鼻咽癌細胞株HONE細胞接觸，收集細胞接觸后的溶液；

6、多輪篩選：將步驟5得到的細胞接觸后的溶液替代步驟2的隨機單鏈DNA文庫，重復步驟2-5至少一次，分析，確認，得到所述核酸適配體。

5.如權利要求4所述的篩選方法，其特征是，所述步驟4的所述變性處理，分離的方法是，加入強堿性溶液，離心，收集上清液，將上清液過除鹽柱后收集滴下的溶液，得到單鏈DNA文庫。

6.如權利要求4所述的篩選方法，其特征是，所述步驟6中，分析，確認的方法為，在步驟2得到的CNE2細胞的特異核酸適配體文庫中加入胎牛血清，使用流式細胞儀監測單鏈DNA文庫對人鼻咽癌細胞株CNE2細胞的識別能力，測序，富集度高的為所述核酸適配體。

7.如權利要求1或2所述的核酸適配體、權利要求3所述的核酸適配體衍生物或權利要求4-6所述的篩選方法得到的核酸適配體在檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞中的應用。

8.如權利要求1或2所述的核酸適配體、權利要求3所述的核酸適配體衍生物或權利要求4-6任一項所述的篩選方法得到的核酸適配體在制備檢測人鼻咽癌細胞株CNE2細胞的試劑盒中的應用。