[發明專利]志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201410110726.0
• 申請日: 2014-03-20
• 公開（公告）號: CN104004827A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 董紹旺;劉欽松;郭濤;杜志楠;郭寶柱
• 申請（專利權）人: 山東博奧克生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明提供了一種志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，屬于生物科學領域。?

背景技術

實時熒光定量PCR(real-time?quantitative?PCR)技術，于1996年由美國Applied?Biosystems公司推出，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快等優點成為了分子生物學研究中的重要工具，目前已得到廣泛應用。由于實時熒光定量PCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到的優勢。?

發明內容

一種志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，包含標準陽性模板、陽性對照品、陰性對照品、TaqDNA聚合酶和UNG酶混合液、熒光聚合酶鏈式反應液，其目的在于克服了現有技術的不足。?

本發明通過以下技術方案實現上述目的：?

根據志賀氏菌保守序列設計特異的引物和探針，當樣品中含有志賀氏菌時，前增菌后提取的志賀氏菌DNA通過PCR成指數擴增，在反應過程中志賀氏菌特異的熒光探針跟靶核酸雜交，同時被Taq酶水解，把探針上的熒光基團和淬滅基團分開，從而通過熒光增量來實時判斷志賀氏菌的存在。?

1、根據志賀氏菌管家基因設計引物和探針。?

引物：?

F?Sequence(5’-3’)：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGAT?Tm55.02?

R?Sequence(5’-3’)：AAGCTCCGCAGAGGCACTGAGT?Tm55.75?

探針：CTGCACGCAATACCTCCGGATTCC?

Modification：5’6-FAM，3’BHQ1?

2、志賀氏菌增菌液DNA的制備(水煮法)。?

a將志賀氏菌于肉湯營養培養基平板上劃線分離，置于37℃恒溫培養箱中培養24小時；?

b挑取單菌落于營養肉湯液體培養基中，37℃震蕩培養8小時；?

c加入終濃度為0.5％的甲醛溶液置于37℃恒溫培養箱中滅活24小時。?

d將滅活的菌液置于離心機中10000r/min離心2min，棄上清，用雙蒸水洗兩次，加入適量雙蒸水搖勻；?

e置于金屬浴中煮沸備用。?

3、核酸擴增。?

具體實施方式：

以下通過實例更詳細地對本發明的技術要點進行解釋，為更好地理解本發明提供依據。?

1、靈敏度：檢測的最高稀釋度可達10-8～10-7，定量檢測線性范圍可達10-1010拷貝/ml。?

2、特異性：采用最新基因序列數據庫設計，并通過系統驗證，本試劑盒能夠檢測所有己知志賀氏菌毒株。對于其它菌株，本試劑盒檢測結果為陰性。?

3、具體實施方式?

下面結合具體實例對本技術發明做進一步說明。?

實施例1?

檢測試劑盒的性能評估?

檢測方法靈敏度評估?

通過對市面上購買來的40份食品樣品采用細胞培養、常規PCR、熒光定量PCR3種方法檢測同時進行比較驗證，結果熒光定量PCR法對LM的檢出率為1215％，高于常規PCR的1010％和細菌培養分離的510％。如采用傳統的細菌培養法進行細菌分離，雖然是一種經典方法，但全過程至少需要4～7d，通常檢出限為1000cfu/ml，而采用本方法，檢出限為10cfu/ml。?

實施例2?

臨床樣品中志賀氏菌的熒光定量PCR檢測：?

檢測樣本類型：?

肛拭子、糞便等。?

適用儀器：?

ABI系列熒光定量PCR儀、Roche系列熒光定量PCR儀、Qiagen?Rotor?Gene等熒光定量PCR儀?。