[發明專利]志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201410110726.0
• 申請日: 2014-03-20
• 公開（公告）號: CN104004827A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 董紹旺;劉欽松;郭濤;杜志楠;郭寶柱
• 申請（專利權）人: 山東博奧克生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒，包括DNA提取液、PCR反應液、Taq酶和UNG酶混合液、沙門氏菌陽性對照、陰性對照。其特征在于，PCR反應液中所含志賀氏菌特異性引物序列和探針，所述引物與探針如下：?

上游引物序列：Sequence(5’-3’)：GTTCCTTGACCGCCTTTCCGAT?

下游引物序列：RSequence(5’-3’)：AAGCTCCGCAGAGGCACTGAGT?

探針：CTGCACGCAATACCTCCGGATTCC?Modification：5’6-FAM，3’BHQl?。

2.根據權利要求1所述的一種志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒PCR反應液中所含10×Buffer2.5μL/反應，Mg離子濃度為800μM，dNTP濃度為400μM，上下游引物濃度為0.2μM，探針濃度為0.3μM，Taq酶和UNG酶混合液中Taq酶濃度為50U/μL，UNG酶濃度為2U/μL。?

3.根據權利要求1所述的一種志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于包含以下步驟：?

a取增菌液1ml加到1.5ml無菌離心管中，10,000rpm離心5min，棄去上清；加入50ul?DNA提取液，充分混勻后沸水浴5min，13,000rpm離心5min，取上清液進行檢測或保存于-20℃以待檢測。?

b將PCR反應液置室溫平衡，融化后取Taq酶和UNG酶混合液，按1μL/管加入酶混合液，即每個測試反應體系配制為：PCR反應液20ul+1ulTaq酶。?

c加入模板：將保存在-20℃的核酸提取物置室溫解凍，以13,000rpm離心5min。陰、陽性對照使用前置室溫解凍。在每個PCR反應管中分別加入步驟1中處理過的模板或陰、陽性對照各4uL，蓋好管蓋，置于PCR儀上，記錄相應樣品號。?

d上機擴增、檢測區：反應條件為50℃：2min，1個循環；95℃：3min，1個循環；95℃：5sec，55℃：60sec(信號采集)，40個循環。反應體系設?為25ul。?

e檢測樣本Ct值≤35.0時，報告陽性。?

檢測樣本Ct值＞35.0且Ct值＜40時，需重復檢測一次，如果Ct值仍＜40，但曲線有明顯的對數增長特性，報告本陽性，否則報告陰性。樣本不顯示Ct值時，報告陰性。?

4.如權利要求書1所述的檢測方法，其特征在于其反應體系為：?

組分???????終濃度?

上游引物：0.16μM?

下游引物：0.16μM?

探針：0.24μM?

dNTP：320μM?

dUTP：320μM?

Mg：640μM?

10×Buffer：1×?

Taq酶：5U/反應?

UNG酶：0.2U/反應?

模板：4uL?

水：補至25uL?。