[發明專利]一種比伐盧定中三氟乙酸的含量測定方法

有效

• 申請號: 201410109919.4
• 申請日: 2014-03-21
• 公開（公告）號: CN103837626A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 吳雪英;喬春蓮;于艷春;楊波;耿海明
• 申請（專利權）人: 武漢武藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/36
• 分類號: G01N30/36;G01N30/02
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 侯蔚寰

技術領域：

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種高效液相色譜法測定比伐盧定中三氟乙酸含量的方法。

背景技術：

比伐盧定為新型抗凝藥，抗凝成分是水蛭素衍生物（片段），系一合成20肽，相對分子量2180。本品為凝血酶直接的、特異的、可逆性抑制劑。無論凝血酶處于血循環中還是與血栓結合，本品均可與其催化位點和陰離子結合位點（又稱底物識別位點）發生特異性結合，從而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解本品多肽順序中Arg3和Pro4之間的肽鍵，使本品失活，所以本品對凝血酶的抑制作用是可逆而短暫的，大大降低了臨時抗凝帶來的出血風險，使該藥在高危患者中也得到了廣泛的應用，取得了較好的臨床應用效果。

在比伐盧定的合成工藝中，為保護比伐盧定的氨基游離而遭受氧化而變質，最后一步是將比伐盧定制成三氟乙酸鹽，以保證比伐盧定的質量。通過檢測比伐盧定中三氟乙酸的含量，來保證其均已成鹽（全部成鹽后，三氟乙酸的理論含量為9.5%）。

三氟乙酸的含量測定方法多采用氣相色譜法，由于三氟乙酸的極性大，酸性強，所以對氣相色譜柱損傷大，分析成本高，且效果不很理想。而用氧瓶燃燒法測定氟的含量，操作繁瑣且誤差較大。也可以考慮用強酸型陽離子交換色譜柱測定三氟乙酸的含量，但也不是實驗室常用手段。

目前比伐盧定中三氟乙酸的含量測定已發表（高效液相色譜法測定比伐盧定中三氟乙酸含量，中國生化藥物雜志，2010年第30卷第2期）的方法為HPLC法，具體如下：

精密稱取三氟乙酸對照品適量，用流動相配制成每1ml中含0.5mg三氟乙酸的溶液，作為對照品溶液；精密稱取比伐盧定適量，用流動相配制成每1ml中含比伐盧定5mg的溶液，作為供試品溶液。照高效液相色譜法（中國藥典2010年版二部附錄V?D）測定。用十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18柱）為填充劑，以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）為流動相；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為210nm。分別精密量取供試品溶液和對照品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，得到樣品中三氟乙酸的含量。

經研究發現，在實際操作過程中，上述方法存在不足：采用上述流動相無法將比伐盧定從C18柱上洗脫下來，雖多次進樣尚未發現其對三氟乙酸測定存在干擾，但主峰未洗脫易使色譜柱污染而減少其壽命。

發明內容：

為了解決上述問題，本發明的技術方案是提供了一種檢測方法，克服了比伐盧定不易從色譜柱上洗脫下來的缺點。本發明的技術方案特點是：以磷酸溶液為流動相A，甲醇為流動相B，其中，流動相A為0.05%～0.10%磷酸溶液，磷酸溶液要用10%氫氧化鈉溶液調pH值至3.01～4.00；采用梯度洗脫的方式，該梯度洗脫的方式很容易將比伐盧定從色譜柱上洗脫下來。

本發明的具體的梯度洗脫的方式，包括流動相濃度，洗脫時間如下表：

其中優選梯度洗脫的方式，包括流動相濃度，洗脫時間如下表：

本發明通過梯度洗脫的方式，使得比伐盧定能夠從C18柱上洗脫，并且確保了三氟乙酸和比伐盧定的分離度符合要求，從而確保了比伐盧定原料的質量可控（結果見附圖1-3）。

本發明還對比伐盧定中三氟乙酸的含量測定方法進行了深入研究：

1.色譜條件的選擇

（1）流動相

我們通過實驗比較了以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）為流動相和以0.05%～0.10%磷酸溶液（用10%氫氧化鈉溶液調pH值至3.01～4.00）為流動相A，甲醇為流動相B，進行梯度洗脫的流動相測定樣品的色譜圖。以0.07%磷酸溶液（pH3.0）-甲醇（98:2）為流動相的樣品色譜圖，比伐盧定峰未洗脫出；而以0.05%～0.10%磷酸溶液（用10%氫氧化鈉溶液調pH值至3.01～4.00）為流動相A，甲醇為流動相B，進行梯度洗脫的流動相測定樣品的色譜圖，基線平穩，三氟乙酸與比伐盧定完全分離，峰型對稱，響應高（見圖1和圖2）

（2）樣品濃度

為了能準確的檢測出樣品中所含三氟乙酸的量，我們分別比較了進樣量為20μl濃度為5mg/ml，10mg/ml和15mg/ml的供試品的色譜圖和三氟乙酸含量，實驗結果表明，濃度為10mg/ml的樣品測得三氟乙酸含量最高，且主峰峰型對稱沒有過載，因此確定比伐盧定中三氟乙酸含量測定樣品濃度為10mg/ml。

2.檢測條件的驗證