[發明專利]石墨烯－CpG制備方法及應用

有效

• 申請號: 201410109624.7
• 申請日: 2014-03-24
• 公開（公告）號: CN103861118A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 任輝;湯鈞;史瑩;王丹;林巍;于曉強;趙樹理;張研
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;A61K31/7105;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

技術領域

本發明涉及一種石墨烯－CpG制備方法及應用，用于醫藥領域。

背景技術

石墨烯在生物醫藥領域的應用面臨著引起炎癥反應的缺點。CpG寡核苷酸片段是最早于細菌中發現的能有激發免疫系統的殺傷作用的識別分子。目前，常被用于免疫治療或免疫輔助治療中。TLR-9是CpG發揮作用的胞內信號分子。但是人工合成的CpG寡核苷酸通常難以進入細胞，如何尋找穩定、高活性和生物相容性好的載運體系是CpG藥物應用的關鍵。石墨烯或者CpG的單獨應用，穩定性差，細胞攝取效率低。使得二者的生物治療應用明顯受到限制。

發明內容

本發明的目的在于提供一種石墨烯－CpG制備方法及應用，其制備方法獨特，可明顯抑制乳腺腫瘤和結直腸腫瘤的生長，比較PBS組差異顯著，腫瘤體生長明顯受到抑制，具有統計學意義。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種石墨烯－CpG制備方法，其特征在于具體步驟如下：

（一）首先功能化石墨烯（Graphene）

1）?稱量1mgGraphene和5mg?PL-PEG5000-Amine（生物素－聚乙二醇）或者PL-PEG2000-Amine加入20ml直筒型厚壁玻璃管，加入5ml蒸餾水，置于搖床搖動至DSPE-PEG完全溶解；

2）置于Vrtis?VirSonic?300S水浴超聲機中超聲處理60分鐘，每間隔5～10分鐘輸出功率調到7級，然后每次去水加冰至水浴箱中，避免過熱；

3）室溫下，離心Graphene懸浮液3h，轉速24000g，收集上清液；

4）記錄所獲得的Graphene溶液UV-VIS-NIR吸收光譜；Graphene終濃度正常范圍是40～70mg/L，4°C保存；

5）從第3步驟制備的原液中取出1ml放入具有100kDa分子量篩截（MWCO）作用的4ml的Aicon離心過濾裝置中，加入3ml蒸餾水，室溫，離心10min，轉速3000g，濾器中的殘留物體積應該小于0.5ml，加蒸餾水至4ml，離心，重復加水，離心，共3次，以保證完全去除Graphene溶液中多余的PL-PEG，最后一步清洗完畢后，應用UV–VIS–NIR分光光度儀（重量消光系數是808nm，0.0465?l?mg^?1?cm^?1）檢測Graphene溶液濃度，加入蒸餾水調整Graphene濃度至100mg/L備用；

（二）再將石墨烯與寡核苷酸CpG結合

6）應用1mg?Sulfo-LC-SPDP（磺基丁二酸亞胺基丙酸酯）混合第5步中的PL-PEG2000-amine功能化的Graphene?50μlg/500μl，加入50ul?10×PBS，室溫下孵育2h；

7）?第6步開始后，立即制備10mM?DTT溶液（1.54mgDTT+1ml蒸餾水），15μl?DTT溶液制成100μM?CpG?100μl，室溫下，反應1.5h；

8）第6步后，應用Amicon（超過濾器）離心設備（截留分子量MWCO?=?100?kDa）去除Graphene溶液中多余的Sulfo-LC-SPDP；加入4ml?DNase/RNase-free水，離心10min，轉速3000g，清洗3次，濾器中的殘留體積應該小于0.5ml；

9）第7步后，與第8步同時進行，應用NAP-5?column?Sephadex?G-25?DNA?Grade?（甲氧萘丙酸,2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸）葡聚糖柱蛋白凝膠分離）（GE?Healthcare,?17-0853-01）純化CpG處理的DTT；應用500?μl?DNase/RNase?free?1?×?PBS洗滌柱中的CpG，保存10～20?μl?DNA樣品；

10）應用第9步中的純化的CpG?500?μl重懸第8步中活性Graphene；結合過程在4?°C下持續24h；Graphene和CpG的終濃度分別是40?mg?l^?1?and?5μg/μl；

11）過濾活性Graphene溶液3次，收集每次過濾的上清液測量OD值；通過底物總上清（總共3次）計算第9步中的CpG終濃度?，CpG終濃度＝第9步－第11步；

石墨烯－CpG用于治療乳腺腫瘤和結直腸腫瘤的藥物應用。