[發明專利]石墨烯－CpG制備方法及應用

有效

• 申請號: 201410109624.7
• 申請日: 2014-03-24
• 公開（公告）號: CN103861118A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 任輝;湯鈞;史瑩;王丹;林巍;于曉強;趙樹理;張研
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;A61K31/7105;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

1.一種石墨烯－CpG制備方法，其特征在于具體步驟如下：

（一）首先功能化石墨烯（Graphene）

1）?稱量1mgGraphene和5mg?PL-PEG5000-Amine（生物素－聚乙二醇）或者PL-PEG2000-Amine加入20ml直筒型厚壁玻璃管，加入5ml蒸餾水，置于搖床搖動至DSPE-PEG完全溶解；

2）置于Vrtis?VirSonic?300S水浴超聲機中超聲處理60分鐘，每間隔5～10分鐘輸出功率調到7級，然后每次去水加冰至水浴箱中，避免過熱；

3）室溫下，離心Graphene懸浮液3h，轉速24000g，收集上清液；

4）記錄所獲得的Graphene溶液UV-VIS-NIR吸收光譜；Graphene終濃度正常范圍是40～70mg/L，4°C保存；

5）從第3步驟制備的原液中取出1ml放入具有100kDa分子量篩截（MWCO）作用的4ml的Aicon離心過濾裝置中，加入3ml蒸餾水，室溫，離心10min，轉速3000g，濾器中的殘留物體積應該小于0.5ml，加蒸餾水至4ml，離心，重復加水，離心，共3次，以保證完全去除Graphene溶液中多余的PL-PEG，最后一步清洗完畢后，應用UV–VIS–NIR分光光度儀（重量消光系數是808nm，0.0465?l?mg^?1?cm^?1）檢測Graphene溶液濃度，加入蒸餾水調整Graphene濃度至100mg/L備用；

（二）再將石墨烯與寡核苷酸CpG結合

6）應用1mg?Sulfo-LC-SPDP磺基丁二酸亞胺基丙酸酯混合第5步中的PL-PEG2000-amine功能化的Graphene?50μlg/500μl，加入50ul?10×PBS，室溫下孵育2h；

7）?第6步開始后，立即制備10mM?DTT溶液（1.54mgDTT+1ml蒸餾水），15μl?DTT溶液制成100μM?CpG?100μl，室溫下，反應1.5h；

8）第6步后，應用Amicon超過濾器離心設備，截留分子量MWCO?=?100?kDa去除Graphene溶液中多余的Sulfo-LC-SPDP；加入4ml?DNase/RNase-free水，離心10min，轉速3000g，清洗3次，濾器中的殘留體積應該小于0.5ml；

9）第7步后，與第8步同時進行，應用NAP-5?column?Sephadex?G-25?DNA?Grade?（甲氧萘丙酸,2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸）葡聚糖柱蛋白凝膠分離）（GE?Healthcare,?17-0853-01）純化CpG處理的DTT；應用500?μl?DNase/RNase?free?1?×?PBS洗滌柱中的CpG，保存10～20?μl?DNA樣品；

10）應用第9步中的純化的CpG?500?μl重懸第8步中活性Graphene；結合過程在4?°C下持續24h；Graphene和CpG的終濃度分別是40?mg?l^?1?and?5μg/μl；

11）過濾活性Graphene溶液3次，收集每次過濾的上清液測量OD值；通過底物總上清（總共3次）計算第9步中的CpG終濃度?，CpG終濃度＝第9步－第11步。

2.石墨烯－CpG用于治療乳腺腫瘤和結直腸腫瘤的藥物應用。