[發明專利]一種誘導多能性干細胞的培養體系

有效

• 申請號: 201410109226.5
• 申請日: 2014-03-21
• 公開（公告）號: CN104928251B
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發明（設計）人: 周琪;顧奇;郝捷;王柳
• 申請（專利權）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 郭廣迅

本發明提供一種用于誘導多能性干細胞的培養基，所述培養基為LBX液體培養基，所述干細胞為豬干細胞、小鼠干細胞、猴干細胞或人干細胞；本發明還提供了使用本發明的培養基誘導多能干細胞的方法。本發明首次發明一種可以很好地提高多種誘導多能性的誘導效率的培養基。該培養基成本較低。本發明誘導的誘導多能性干細胞更傾向于小鼠樣的狀態，可以單個細胞傳代，有利于大規模的擴增和后臨床應用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種誘導多能性干細胞的培養體系，具體地，本發明涉及一種誘導多能性干細胞的培養體系，其制備方法及其應用。

背景技術

小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）和人胚胎干細胞的建立開創了生物和醫學的新領域，胚胎干細胞以自我更新和向各個胚層細胞分化的能力為研究個體發育和細胞分化提供了有力的工具，并在再生醫學和組織工程領域具有廣闊的應用前景，很快就應用于細胞治療和疾病模型研究，它可以為人類無法自身修復的疾病（帕金森，糖尿病等）提供組織再生的替代細胞。

豬的胚胎干細胞的建立將對農業生產和生物醫學起著至關重要的作用。但是目前為止還沒有一株被承認的豬胚胎干細胞系被建立。在這近20年的豬胚胎干細胞研究過程中，大家在一直探索和追尋怎樣才能建立出豬的胚胎干細胞并且解釋豬胚胎干細胞無法容易建立的原因。最成功的豬胚胎干細胞系是在1990年被Evan等人建立，可以傳10代左右，但之后會呈現上皮樣細胞的生長。之后經過了一系列的努力，但沒有一株胚胎干細胞系被認可，分化能力較差，更沒有嵌合能力。雖然有報道豬的依賴于Activin/Nodal信號通路的上胚層干細胞系被建立，但是無論是分子標記的表達還是分化能力都不是很明確。

在沒有成功的細胞系被建立時，大家都在猜測各種各樣的原因，比如豬胚胎的發育時程問題，豬胚胎的著床問題，合子基因問題，多能性基因表達和飼養層等問題，但是這一切都沒有好的解決手段或是針對性的分析方法，一切還是停留在描述的階段。

自小鼠誘導多能性干細胞（induce pluripotent stem cells,iPS）細胞建立之后，人們在想是否可以通過外源基因導入的手段來建立豬的多能性干細胞系。2009第一株豬iPS細胞系被建立，之后得到多個實驗室的重復，但是分子表達標記有些差異，尤其是針對SSEA1和SSEA4，但令人失望的是外源基因的表達是維持多能性狀態所必須的，雖然有報道可以進行嵌合體實驗，至今卻沒有得到其他實驗室的重復。更令人奇怪的是豬iPS細胞的核移植胚胎發育率遠遠低于正常的體細胞，并且克隆胚胎的體內發育率更是極低，極少的胎兒能夠正常出生。

雖然很多實驗室進行了小分子的添加來誘導多能性干細胞。但是效果不甚理想，針對上述問題，本發明首先對誘導的培養體系的摸索和優化，能夠較高效率的獲得豬iPS，并且這些豬iPS更傾向于小鼠樣的克隆，可以單個細胞傳代，有較高的發育潛能和更好的轉基因效率。由于小鼠，猴子和人的細胞也存在誘導效率較低的問題，因此，當前存在能誘導多能性干細胞并提高其誘導效率的培養基的需要。

發明內容

因此，本發明的一個目的是提供一種用于誘導多能性干細胞的培養基，本發明的另一個目的是提供該培養基的制備方法及其應用。

一方面，本發明提供了一種用于誘導多能性干細胞的培養基，所述培養基為LBX液體培養基，包括氨基酸、維生素、無機鹽及其它組分；

其中，所述氨基酸包括50-150mg/L的L-精氨酸鹽酸鹽、10-20mg/L的L-組氨酸鹽酸鹽一水物、25-50mg/L的L-異亮氨酸、25-50mg/L的L-亮氨酸、40-80mg/L的L-賴氨酸鹽酸鹽、7-15mg/L的L-蛋氨酸、18-40mg/L的L-苯丙氨酸、17-40mg/L的L-絲氨酸、17-60mg/L的L-蘇氨酸、2-8mg/L的L-色氨酸、15-50mg/L的L-酪氨酸二鈉鹽和10-60mg/L的L-纈氨酸；