[發明專利]一株能降低黃酒中生物胺的釀酒酵母及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201410106846.3
• 申請日: 2014-03-21
• 公開（公告）號: CN104046572B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發明（設計）人: 肖冬光;郭學武;陳葉福;杜麗平;張翠英;董健;李立娜;吳德光
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/18
• 分類號: C12N1/18;C12N15/81;C12G3/02;C12R1/865
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙)11348
• 代理人: 王偉鋒

技術領域：

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一株能降低黃酒發酵中生物胺含量的釀酒酵母基因工程菌及其應用。?

背景技術：

生物胺是一類堿性含氮化合物，主要由微生物體內的游離氨基酸脫羧而成。因為其潛在的毒性作用和對生產衛生條件的指示作用而受到消費者、制造商和研究者的廣泛關注，是目前食品安全問題研究的主要對象之一。其中，酪胺，尸胺，腐胺在各種發酵食品中存在最為廣泛，含量也相對較高，危害較大。?

一般來說，由微生物生產生物胺有三個條件：一、有可利用的自由氨基酸；二、氨基酸脫羧酶陽性微生物的存在；三、有適宜的環境條件，利于細菌的生長、脫羧酶的合成和提高脫羧酶活性的條件。?

酵母蛋白酶A(PrA)是蛋白酶中最主要的水解酶之一，它能催化細胞內蛋白質水解，特別在氮缺乏、孢子形成時，酵母通過PrA水解蛋白質為孢子合成新蛋白提供氨基酸來源。PrA是一種天冬氨酸蛋白酶，由XVI號染色體上的PEP4基因編碼。改變PrA的前驅物pro-PrA的氨基酸組成能降低PrA的酶活。在很多發酵食品生產過程中，除了來源于原料中的氨基酸，PrA水解蛋白質也是自由氨基酸產生的原因之一。?

近年來，國內已有一些資深企業、高校和科研機構利用該手段對釀酒酵母的PrA編碼基因PEP4進行了相關的研究和探討，并在降低純生啤酒PrA活力、提高泡持性方面取得了實質性的進展。本發明同樣利用基因工程手段構建低表達PrA的釀酒酵母工業菌株，但其目的與用途和上述研究成果截然不同。?

有文獻報道，改變PrA的前驅物—proPrA的氨基酸組成能降低PrA的酶活，其理論依據是proPrA含有從高爾基體定位至液泡的分選信號，該分選信號就包含在N-端由54個氨基酸組成的前肽中(圖1)。當proPrA進入液泡之前，N-端的前肽將會在完成定位作用后被水解下來，從而使成熟的PrA進入液泡。該54氨基酸組成的前肽除涉及PrA的抑制/活化的轉換作用外，對于形成成熟的活性PrA具有極其關鍵的作用。而且在PrA形成過程的前期，如果缺乏該54氨基酸的肽段，PrA進入內質網中時將會被完全降解。因此，本發明基于這一理論，采用同源重組技術敲除該54個氨基酸組成的前肽編碼序列，即PEP4前肽基因，從而構建一株PrA低表達的基因工程菌。?

目前報導最多的具有氨基酸脫羧酶活性的微生物主要是乳酸菌，腸桿菌，假單胞菌等細菌。許多屬的乳酸菌具有氨基酸脫羧能力，這一反應有利于乳酸菌的在酸性環境中的生長和存活，因為產生的生物胺可以使環境的pH上升。?

黃酒是我國的民族特產，也稱為米酒(rice?wine)，屬于釀造酒，是世界三大最古老的酒種(黃酒、葡萄酒和啤酒)之一。黃酒是以稻米、黍米、小米、玉米、小麥等為主要釀造原料，由多種微生物(霉菌、酵母和細菌)共同參與，在開放式的環境中釀制而成的一種低酒精度發酵酒，一般酒精含量為14％～20％。?

黃酒具有豐富的營養價值，黃酒中氨基酸含量遠遠高于其他酒類，是啤酒的9.8倍和葡萄酒3.5倍，其種類超過21種，特別包含了人體必需的8種氨基酸。黃酒中氨基酸的來源主要是米飯和麥曲中所含蛋白質經蛋白酶分解后產生的氨基酸和酵母等微生物自溶后內容物釋放產生，有“液體蛋糕”之稱。?

由于黃酒生產的開放式多菌種發酵，及大量豐富的氨基酸的存在，目前黃酒中普遍檢測到存在生物胺等潛在的有害物質，因此降低黃酒中生物胺含量是黃酒工業急需解決的難題之一。?

發明內容：

本發明所要解決的技術問題就是針對目前黃酒中普遍存在生物胺的缺陷，提供一株敲除PEP4前肽基因的釀酒酵母基因工程菌以及該菌株在降低黃酒中生物胺含量方面的應用，其能減少在黃酒發酵后期由于酵母自溶PrA分泌到胞外分解菌體等蛋白質產生自由氨基酸的量，從而降低生物胺的生成。?

本發明的技術方案之一是：提供一株釀酒酵母基因工程菌，所述基因工程菌為用于黃酒生產的釀酒酵母中敲除酵母蛋白酶A編碼基因的前肽基因，即PEP4前肽基因所得；?

所述PEP4前肽基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：1；?

優選的，所述基因工程菌的出發菌株為釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)RY1，編號CGMCC?No2.1525。?

本發明所采用的技術方案之二是：一種用于基因敲除的重組質粒，其依次含有酵母蛋白酶A編碼基因PEP4前肽基因的上、下游兩條同源臂以及標記基因KanMX；?