[發明專利]一株能降低黃酒中生物胺的釀酒酵母及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201410106846.3
• 申請日: 2014-03-21
• 公開（公告）號: CN104046572B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發明（設計）人: 肖冬光;郭學武;陳葉福;杜麗平;張翠英;董健;李立娜;吳德光
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/18
• 分類號: C12N1/18;C12N15/81;C12G3/02;C12R1/865
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙)11348
• 代理人: 王偉鋒

1.一種基因工程菌，是對生產黃酒的釀酒酵母進行基因工程改造獲得的菌；所述基因工程改造為敲除所述生產黃酒的釀酒酵母中酵母蛋白酶A編碼基因的前肽基因，即PEP4前肽基因。

2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述生產黃酒的釀酒酵母為釀酒酵母RY1，保藏編號CGMCC?No2.1525。

3.根據權利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于：所述PEP4前肽基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：1所示。

4.一種構建權利要求1或2中任一所述的基因工程菌的方法，包括如下步驟：

（1）將含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子及標記基因KanMX插入質粒中，得到重組質粒；

所述含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子分別為含有PEP4前肽基因上、下游同源臂的基因片段；

（2）以重組質粒為模板擴增出含有PEP4前肽基因同源臂及標記基因KanMX的重組片段，將重組片段轉化入出發菌株的兩種單倍體菌株—a型和α型中，得到重組后的a型和α型基因工程單倍體菌株；

（3）將pGAPza質粒導入所述重組后的a型和α型基因工程單倍體菌株中，純化并融合后得到所述基因工程菌。

5.根據權利要求4所述的一種基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）重組質粒的構建

將含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子及標記基因KanMX插入質粒中，得到重組質粒；

所述含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子分別為含有PEP4前肽基因上、下游同源臂的基因片段；

（2）PEP4前肽基因的敲除

①以步驟（1）中的重組質粒為模板，擴增出含有PEP4前肽基因同源臂及標記基因KanMX的重組片段；

②用醋酸鋰轉化法將①中的重組片段轉化入出發菌株的a型和α型菌株中，得到重組后的基因工程單倍體菌株；

（3）KanMX抗性基因的去除

①利用醋酸鋰轉化法將pGAPza質粒轉入步驟（2）-②中的基因工程單倍體菌株中，

②用Zeocin抗性平板篩選轉化子，挑選在YEPD平板上生長而在G418平板上不生長的基因工程單倍體菌株，包括a型和α型；

（4）pGAPza質粒丟失

將步驟（3）-②中挑選的a型和α型基因工程單倍體菌株于YEPD液體培養基中進行傳代培養，選取第一代及第八代以后各培養物提取酵母質粒并以此為模板，用引物Zeocin-up與Zeocin-down進行PCR擴增，驗證pGAPza質粒是否丟失；

（5）獲得基因工程菌

將步驟（4）中驗證得到的pGAPza質粒丟失的a型和α型單倍體酵母突變株經純化后進行融合，篩選雙倍體即得到所述基因工程菌。

6.根據權利要求4或5所述的一種基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述PEP4前肽基因上游同源臂的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：2所示；所述PEP4前肽基因下游同源臂的核苷酸序列如序列表中序列SEQ?ID?NO：3所示。

7.根據權利要求4或5所述的一種基因工程菌的構建方法，其特征在于：所述重組質粒的載體為pUC19質粒。

8.權利要求1或2所述的基因工程菌在生產低含量生物胺的黃酒中的應用。

9.根據權利要求8所述的基因工程菌在生產低含量生物胺的黃酒中的應用，其特征在于：使用所述基因工程菌發酵生產黃酒的方法如下：

取權利要求1所述的基因工程菌一環，接種于5mL麥芽汁培養基中，30℃，150r/min，搖瓶發酵12h后全部轉接于相同麥芽汁的50mL三角瓶中，30℃，150r/min，繼續搖瓶發酵24h后按10%的接種量接種到大米固體培養基中，30℃恒溫培養箱中進行前酵實驗，5天后，調整恒溫培養箱溫度至30℃進行后酵實驗15天。

10.如權利要求9所述的基因工程菌在生產低含量生物胺的黃酒中的應用，其特征在于：

所述麥芽汁培養基的制備如下：

大麥芽1000g，粉碎成粉，將粉好的麥芽粉加入4倍體積水（水溫60℃）置于小鍋中糖化，小鍋置于55℃-60℃的恒溫水浴中糖化5-6h，期間不斷攪拌，糖化液紗布靜置過濾，過濾后的糖化液煮沸1h,冷卻，雙層紗布過濾一次，即得到澄清麥芽汁，麥芽汁糖度在12-13Bix，115℃，15min滅菌；

所述大米固體培養基的制備：

浸米：25-30℃，浸漬72h；

洗米：洗米時保留部分的浸米水，剛洗米的三道水倒掉，適度保留米漿水的乳酸味；

蒸煮：浸好的大米常壓蒸50min左右，直到顆粒均勻、內心無白，冷卻；

配料：粳米：100g；熟麥曲：10g；水：105ml（清水60ml、漿水45ml，不包括浸米吸水和蒸飯吸水）接種量：10%（30mL）。