[發(fā)明專(zhuān)利]一種生產(chǎn)L-丙氨酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410106588.9
• 申請(qǐng)日: 2014-03-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103923955B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李榮杰;尚海濤;楊為華;鄧遠(yuǎn)德;徐斌;許鵬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12P13/06
• 分類(lèi)號(hào): C12P13/06;C12R1/38
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)L?丙氨酸的方法，涉及基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，是利用天冬氨酸?β?脫羧酶交聯(lián)聚集體固相酶生產(chǎn)L?丙氨酸。本發(fā)明方法使用PCR方法從德阿昆哈假單胞菌中獲得天冬氨酸?β?脫羧酶的編碼基因，誘導(dǎo)天冬氨酸?β?脫羧酶的表達(dá)，再對(duì)其進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)得到天冬氨酸?β?脫羧酶交聯(lián)聚集體固相酶，以其為酶，以L?天冬氨酸作為底物，生產(chǎn)L?丙氨酸。每升反應(yīng)液中，L?天冬氨酸底物濃度達(dá)1800g/L，酶促反應(yīng)20小時(shí)后摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)99.9%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用天冬氨酸-β-脫羧酶交聯(lián)聚集體固相酶生產(chǎn)L-丙氨酸的方法。

背景技術(shù)

L-丙氨酸是一種應(yīng)用十分廣泛的氨基酸，其外觀為白色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭有甜味，溶于水和乙醇，難容于乙醚。在食品上廣泛添加于化學(xué)調(diào)味品、飲料、有機(jī)酸、酒類(lèi)及腌制品中，作為一種重要的添加劑，同時(shí)具有增鮮保鮮的作用。L-丙氨酸在醫(yī)藥上主要是合成維生素B6和氨基丙醇的重要原料，是組成復(fù)合氨基酸注射液和口服液的原料。隨著對(duì)L-丙氨酸不斷研究和開(kāi)發(fā),在醫(yī)藥和食品等行業(yè)的應(yīng)用不斷擴(kuò)大，并有日益增長(zhǎng)的趨勢(shì)。L-丙氨酸產(chǎn)品全球年需要量將超過(guò)30000噸。

目前利用固定化細(xì)胞酶轉(zhuǎn)化法是最為有效的工業(yè)化生產(chǎn)L-丙氨酸之一。即利用菌體中的天冬氨酸-β-脫羧酶以L-天冬氨酸為原料，酶法脫梭生成L-丙氨酸。由于天冬氨酸-β-脫羧酶位于菌體內(nèi)，作為底物的L-天冬氨酸必須通過(guò)菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢，在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，生產(chǎn)周期長(zhǎng)達(dá)4-5天。菌體內(nèi)含有雜酶，特別是氨基酸消旋酶作用于L-丙氨酸產(chǎn)出D-丙氨酸，影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此迫切需要一種生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物濃度高，雜質(zhì)少的生產(chǎn)L-丙氨酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服上述固相化細(xì)胞生產(chǎn)L-丙氨酸技術(shù)不足，利用基因工程技術(shù)表達(dá)天冬氨酸-β-脫羧酶，制備天冬氨酸-β-脫羧酶交聯(lián)聚集體固相酶，再利用此固相酶。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供天冬氨酸-β-脫羧酶交聯(lián)聚集體固相酶的制備方法，包括：

（1）使用PCR方法從德阿昆哈假單胞菌（Pseudomonas dacunhae）中獲得天冬氨酸-β-脫羧酶的編碼基因；

（2）PCR產(chǎn)物連接載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，超聲波破碎菌體，收集上清液，再進(jìn)行分離純化；

（3）用化學(xué)交聯(lián)方法得到天冬氨酸-β-脫羧酶交聯(lián)聚集體固相酶。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物濃度高，雜質(zhì)少的生產(chǎn)L-丙氨酸的方法。

本發(fā)明的生產(chǎn)L-丙氨酸的方法含有以下步驟：

（1）使用PCR方法從德阿昆哈假單胞菌（Pseudomonas dacunhae）中獲得天冬氨酸-β-脫羧酶的編碼基因；

（2）PCR產(chǎn)物連接載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，超聲波破碎菌體，收集上清液，再進(jìn)行分離純化；

（3）用化學(xué)交聯(lián)方法得到天冬氨酸-β-脫羧酶交聯(lián)聚集體固相酶；

（4）以磷酸鹽緩沖液對(duì)步驟（3）獲得的酶進(jìn)行定容，再加入L-天冬氨酸生產(chǎn)L-丙氨酸。

其中，步驟（1）中PCR方法所用的引物為：

正向引物：5′-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3′；

反向引物：5′-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3′。