[發明專利]一種生產L-丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 201410106588.9
• 申請日: 2014-03-20
• 公開（公告）號: CN103923955B
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 李榮杰;尚海濤;楊為華;鄧遠德;徐斌;許鵬
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12R1/38
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種生產L-丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)使用PCR方法從德阿昆哈假單胞菌(Pseudomonas dacunhae)中獲得天冬氨酸-β-脫羧酶的編碼基因；

其中，步驟(1)中PCR方法所用的引物為：

正向引物：5′-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3′；

反向引物：5′-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3′；

(2)PCR產物連接載體、轉化大腸桿菌，超聲波破碎菌體，收集上清液，再進行分離純化；

其中，步驟(2)中PCR產物連接載體后轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，在20-30℃使用乳糖作為誘導劑，誘導天冬氨酸-β-脫羧酶表達；還包括對誘導的培養液在4-6℃，8000rpm離心，收集菌體，菌體以0.1M、pH7.0磷酸鹽緩沖液懸浮，即濕菌體與緩沖液的比例為1g濕菌體:5-6mL緩沖液，在冰浴中以超聲波破碎菌體，破碎后，4-6℃，8000rpm離心收集上清；

步驟(2)中分離純化的方法為硫酸銨分段沉淀法，具體為向上清液中加入5％飽和度的硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，然后在4-6℃，8000-10000rpm離心10min，取上清，再向上清液中緩慢加入25％飽和度硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，靜置1-5h，4-6℃，8000-10000rpm離心10min，收集沉淀物；

(3)用化學交聯方法得到天冬氨酸-β-脫羧酶交聯聚集體固相酶；

其中，步驟(3)所述的化學交聯方法是以戊二醛為交聯劑，將分離純化收集到的沉淀按照1g：10-12mL的比例滴加50％的戊二醛交聯劑，混合均勻于4-6℃下交聯22-24h后離心，取沉淀物，用蒸餾水洗滌3-5次，再用0.1M、pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次，分離得到沉淀即制得天冬氨酸-β-脫羧酶交聯聚集體固相酶；

(4)以磷酸鹽緩沖液對步驟(3)獲得的酶進行定容，再加入L-天冬氨酸生產L-丙氨酸；其中，步驟(4)中對7-9g的天冬氨酸-β-脫羧酶交聯聚集體固相酶使用0.1M，pH7.0的磷酸鹽緩沖液定容至1L；步驟(4)的反應溫度為36-38℃；

步驟(4)向天冬氨酸-β-脫羧酶交聯聚集體固相酶定容液中加入L-天冬氨酸的方法為：初始L-天冬氨酸的加入量為400-500g；反應4小時后，按每小時100g逐步加入天冬氨酸，每升反應液中可轉化L-天冬氨酸量達1800g。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(4)反應期間每4h取樣，16h后每1h取樣，通過HPLC檢測反應溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量，當L-丙氨酸含量不再增加時，即為反應終點。