[發(fā)明專利]一種基因組DNA提取方法及試劑盒

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410103466.4
• 申請(qǐng)日: 2014-03-19
• 公開（公告）號(hào): CN103911366A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘力;周斌;王斌;何攀;呂揚(yáng)勇;廖瑜玲;李秀鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因組DNA提取試劑盒及提取方法。

背景技術(shù)

自PCR擴(kuò)增技術(shù)發(fā)明以來，生物分子學(xué)的研究突飛猛進(jìn)。對(duì)基因的研究己經(jīng)遍及醫(yī)療健康、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)及生物各學(xué)科領(lǐng)域?；蚪MDNA的提取是分子生物學(xué)研究的前提，在上述各領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。提取基因組DNA常用的方法是用物理方法破壁，例如液氮研磨和高溫加熱；或者是酶解，例如溶菌酶酶解；或者非離子表面活性劑處理例如，CTAB法（Walker?WH等，1991）氯化芐法和SDS法（林福呈和王洪凱，2010），細(xì)胞破壁和破膜后利用有機(jī)溶劑使用苯酚、氯仿、異戊醇的混合溶液使蛋白質(zhì)變性達(dá)到與DNA分離的目的。雖然這些方法能夠提取出高質(zhì)量的基因組DNA，但是提取過程中的這些有機(jī)溶劑對(duì)人體皮膚、呼吸道粘膜、眼睛等有較大的傷害，而且提取的基因組常有有機(jī)溶劑殘留，使得后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定；后來又出現(xiàn)了利用DNA吸附材料來達(dá)到蛋白質(zhì)與DNA分離的目的，同時(shí)也開發(fā)了很多試劑盒來提取不同材料的基因組，雖然提取的基因組質(zhì)量很高但成本較高、通用性不強(qiáng)。但是不論是使用苯酚、氯仿等有機(jī)溶劑抽提還是使用DNA提取試劑盒來提取基因組，樣品的預(yù)處理始終是一個(gè)繁瑣和耗時(shí)的過程。革蘭氏陽性細(xì)菌和酵母菌細(xì)胞壁非常堅(jiān)實(shí)，常見的提取基因組方法中都會(huì)加入溶菌酶消化細(xì)胞壁。對(duì)于人類和動(dòng)物組織，需要加入蛋白酶K過夜處理使組織更分散。對(duì)于植物組織和絲狀真菌菌絲或者是真菌孢子，需要使用液氮研磨破壁。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種快速基因組DNA提取試劑盒及其制備方法，該方法可以針對(duì)絕大多數(shù)生物樣品，操作簡單、經(jīng)濟(jì)、無毒無污染，高質(zhì)高效。

一種基因組DNA提取試劑盒，包括溶液A（裂解液）、溶液B（DNA結(jié)合液）、溶液C（DNA洗滌液）和溶液D（DNA洗脫液）；

溶液A（裂解液）：10mM-50mM?Tris-HCl?pH8.0，10mM-50mM?EDTA，1%-10%（w/v）SDS，2M-4M?NaCl，0.5%-2%（v/v）的β-巰基乙醇；

溶液B（DNA結(jié)合液）：2.5-6M的鹽酸胍或者異硫氰酸胍，20%-40%（v/v）異丙醇或者是無水乙醇，5mM-20mM?EDTA，pH4.5-6.5；

溶液C（DNA洗滌液）：70%-80%（v/v）的無水乙醇，pH4.5-6.5；

溶液D（DNA洗脫液）：5-50μg/mL的RNA酶水溶液，用1M?NaOH溶液將pH調(diào)到7.0-8.5。

還包括研磨器：該研磨器可以為電動(dòng)組織研磨器或者小型的手提電鉆其轉(zhuǎn)速800-12000rpm，配有長度為40-80mm，直徑3-7mm的錐形研磨杵。

上述試劑盒的優(yōu)選配方

溶液A：50mM?Tris-HCl、50mM?EDTA、3%SDS、2M?NaCl、1%的β-巰基乙醇，pH8.0；

溶液B：4M的鹽酸胍、20%異丙醇、10mM?EDTA、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液；

溶液C：70%的無水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液

溶液D：20μg/mL的RNA酶水溶液，用1M?NaOH溶液將pH調(diào)到8.0。研磨器：轉(zhuǎn)速8000rpm、配有長度為70mm，直徑5mm的錐形研磨杵。

本發(fā)明的主要原理：研磨器在高速條件下產(chǎn)生的剪切力不僅能將絲狀真菌的細(xì)胞壁破碎，同時(shí)研磨杵與離心管壁的摩擦作用而產(chǎn)生較高的溫度（50℃-70℃），有利于SDS裂解細(xì)胞。在研磨器、高溫和SDS的相互作用下，絲狀真菌的基因組DNA釋放出來。在2M?NaCl溶液中DNA的溶解度最大。EDTA是金屬螯合劑能抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。DNA結(jié)合液提供一個(gè)高鹽低pH值的環(huán)境，在這種條件下，DNA可以與硅膠柱可逆結(jié)合。洗滌液是70%乙醇可以對(duì)硅膠柱脫鹽。DNA在pH7.0-8.5的低鹽溶液中，具有最大洗脫效率。洗脫液是含有RNA酶的堿性水溶液，能將硅膠柱上DNA洗脫下來。

本發(fā)明的另一方面是使用該試劑盒提取基因組DNA的方法，包括以下步驟：

1、樣品的預(yù)處理

（1）取1.5mL的錐底離心管，加入0.1mg-100mg組織樣品或者10⁶-10⁹細(xì)胞樣品；

（2）向（1）中加入50μL-100μL的溶液A；

（3）開動(dòng)研磨器研磨樣品30s-5min；

2、樣品的過柱純化