[發明專利]一種真菌菌絲總DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201410102771.1
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN103820434A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 李小林;鄭林用;李昕竺;曾先富;黃羽佳
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院土壤肥料研究所;成都市農林科學院;四川省技術創新促進會
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/645
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 高蕓;梁鑫

技術領域

本發明屬于真菌的分子生物學研究領域，具體涉及一種真菌菌絲總DNA的提取方法。

背景技術

在真菌的分子生物學研究中，真菌總DNA的提取至關重要。目前常用的提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。提取的步驟大體相似，關鍵在于如何有效地破碎細胞壁，有的是通過機械來進行破碎細胞壁，有的是通過酶等物質來消化去壁。由于真菌細胞壁上富含多糖等物質，因此即使是液氮冷凍干燥研磨后也很難被普通抽提液打破，而直接用酶去消化又常常得不到好的去壁效果。事實上，目前大部分實驗室所采用的破壁方法均是液氮冷凍干燥研磨，但是使用液氮研磨容易凍傷皮膚，需要強力研磨，費時費力，受研缽數量的限制容易產生交叉污染，在研磨過程中真菌菌絲也容易損失，效率也不高，特別是一些單位和機構由于液氮及干冰不易獲取而使其受到嚴重限制。因此急需一種免液氮研磨而又能較為徹底打破細胞壁的真菌提取技術。

發明內容

本發明所解決的技術問題是提供一種免液氮研磨而又能較為徹底打破細胞壁提取真菌菌絲總DNA的技術。

本發明提供的真菌菌絲總DNA的提取方法的技術方案如下：

（1）收集真菌菌絲體；

（2）真菌菌絲體置于DNA提取液中，搗碎真菌菌絲體；

（3）在-70℃至-85℃的低溫環境與60-65℃水浴環境中反復凍融2～3次；

（4）加入蛋白酶K和溶菌酶處理；

（5）去酶及純化DNA。

其中，步驟（2）所述DNA提取液的各組分濃度為：80-120mmol/L?Tris-HCl，80-120mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，80-120mmol/L磷酸鈉，1.0-1.5mol/L氯化鈉，質量百分比為0.8-1%（g/g）十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，pH值=7.8-8.2，溶劑為無菌蒸餾水，溶劑優選滅菌雙蒸水。采用本發明DNA提取液具有毒性低、刺激性小及生物降解性高的優點。DNA提取液的添加量為：每1g真菌菌絲體添加DNA提取液1-1.6ml，優選1.5ml。

進一步優選，步驟（2）所述DNA提取液的各組分濃度為：100mmol/L?Tris-HCl，100mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，100mmol/L磷酸鈉，1.5mol/L氯化鈉，質量百分比為1%（g/g）十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，pH值=8.0，溶劑為無菌蒸餾水；溶劑優選滅菌雙蒸水。

其中，步驟（3）所述的具體條件是：在-70至-85℃的低溫環境放置5-10min，再在60-65℃水浴環境中放置15-20min，如此反復凍融2～3次。

進一步優選，步驟（3）所述的具體條件是：在-80℃的低溫環境放置5-10min，再在65℃水浴環境中放置20min，如此反復凍融2～3次。

其中，步驟（4）所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量為：

按1g菌絲量計算，加入蛋白酶K(8-12mg/mL)40-60μL，溶菌酶(80-120mg/ml)40-60μL，渦旋混勻后，于37℃的環境，在150-200r/min的條件下振蕩15-30min。

進一步優選，按1g菌絲量計算，加入蛋白酶K(10mg/mL)50μL，溶菌酶(100mg/ml)50μL，渦旋混勻后，于37℃的環境，在200r/min的條件下振蕩30min。

本發明采用的蛋白酶K能使膜蛋白降解，使與DNA結合的蛋白質降解，使DNA充分游離；溶菌酶能有效地菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵進而破碎細胞壁，釋放DNA。具有操作簡便，避免使用液氮研磨而帶來的勞動強度和交叉污染的優點。

其中，步驟（5）去酶及純化DNA具體包含下述步驟：

A、加入20%（g/g）十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液180-230μL，渦旋混勻后水浴，水浴條件：58-63℃、1.5-2.0h，期間每10-30min振蕩1次；

B、室溫條件下，5000-6000r/min離心10-15min，取上清液至離心管中待用，于上清液中加入0.4-0.6倍體積50%（g/g）聚乙二醇溶液，在4℃環境下放置過夜；所述聚乙二醇的相對分子質量為4000－6000；