[發明專利]一種真菌菌絲總DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201410102771.1
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN103820434A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 李小林;鄭林用;李昕竺;曾先富;黃羽佳
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院土壤肥料研究所;成都市農林科學院;四川省技術創新促進會
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/645
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 高蕓;梁鑫

1.真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）收集真菌菌絲體；

（2）真菌菌絲體置于DNA提取液中，搗碎真菌菌絲體；

（3）在-70℃至-85℃的低溫環境與60-65℃水浴環境中反復凍融2～3次；

（4）加入蛋白酶K和溶菌酶處理；

（5）去酶及純化DNA。

2.根據權利要求1所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（2）所述DNA提取液各組分濃度為：80-120mmol/LTris-HCl，80-120mmol/L乙二胺四乙酸，80-120mmol/L磷酸鈉，1.0-1.5mol/L氯化鈉，0.8-1%(g/g)十六烷基三甲基溴化銨，pH值=7.8-8.2，溶劑為無菌蒸餾水；優選溶劑為滅菌雙蒸水。

3.根據權利要求2所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（2）DNA提取液的各組分濃度為：100mmol/LTris-HCl，100mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/L磷酸鈉，1.5mol/L氯化鈉，1%(g/g)十六烷基三甲基溴化銨，pH值=8.0，溶劑為無菌蒸餾水；優選溶劑為滅菌雙蒸水。

4.根據權利要求1-3任一項所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（2）DNA提取液的添加量為：每1g真菌菌絲體添加DNA提取液1-1.6ml，優選1.5ml。

5.根據權利要求1所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（3）所述的具體條件是：在-70℃至-85℃的低溫環境放置5-10min，再在60-65℃水浴環境中放置15-20min，如此反復凍融2～3次。

6.根據權利要求5所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（3）所述的具體條件是：在-80℃的低溫環境放置5-10min，再在65℃水浴環境中放置20min，如此反復凍融2～3次。

7.根據權利要求1所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（4）所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量為：

按1g菌絲量計算，加入8-12mg/mL蛋白酶K40-60μL，80-120mg/ml溶菌酶40-60μL，渦旋混勻后，于37℃的環境，在150-200r/min的條件下振蕩15-30min。

8.根據權利要求7所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（4）所述蛋白酶K和溶菌酶的添加量為：

按1g菌絲量計算，加入10mg/mL蛋白酶K50μL，100mg/ml溶菌酶50μL，渦旋混勻后，于37℃的環境，在200r/min的條件下振蕩30min。

9.根據權利要求1所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（5）去酶及純化DNA包括如下步驟：

A、加入20%(g/g)十二烷基硫酸鈉溶液180-230μL，渦旋混勻后水浴，水浴條件：58-63℃、1.5-2.0h，期間每10-30min振蕩1次；

B、室溫條件下，5000-6000r/min離心10-15min，取上清液至離心管中待用，于上清液中加入0.4-0.6倍體積50%(g/g)聚乙二醇溶液，在4℃環境下放置過夜；所述聚乙二醇的相對分子質量為4000－6000；

C、室溫條件下，6000-7000r/min、3-5℃離心25-35min，棄上清液，并于沉淀中加入TE溶液500μL，氯仿-異戊醇體積比為24:1的溶液450-550μL，渦旋混勻，11000-12000r/min，3-5℃離心4-6min，取上清液至離心管中；所述TE溶液各組分的濃度為：10mmol/L?Tris-HCl，1mmol/L?EDTA，pH=7.5-8.5，溶劑為無菌蒸餾水，優選為滅菌雙蒸水；

D、于步驟C所得上清液中加入0.8-1.5倍體積的3mol/LNaAc溶液及0.5-0.6倍體積的異丙醇溶液，沉淀至少2-2.5h，11000-12000r/min，3-5℃離心4-6min，棄掉上清液；

E、于步驟D所得沉淀中加入預冷的70%(v/v)乙醇500-600μL洗滌沉淀，11000-12000r/min，3-5℃離心4-6min，棄掉上清液；

F、沉淀低溫真空干燥，即得真菌菌絲體DNA。

10.根據權利要求9所述的真菌菌絲總DNA的提取方法，其特征在于：步驟（5）去酶及純化DNA包括如下步驟：

A、加入20%(g/g)十二烷基硫酸鈉溶液200μL，渦旋混勻后水浴，水浴條件：60℃、1.5h，期間每30min振蕩1次；

B、室溫條件下，5000r/min離心10min，取上清液至離心管中待用，于上清液中加入0.5倍體積50%(g/g)聚乙二醇溶液，在4℃環境下放置過夜；

C、室溫條件下，6000r/min、4℃離心30min，棄上清液，并于沉淀中加入TE溶液500μL，氯仿-異戊醇體積比為24:1的溶液500μL，渦旋混勻，12000r/min、4℃離心5min，取上清液至離心管中；所述TE溶液各組分的濃度為：10mmol/L?Tris-HCl，1mmol/L?EDTA，pH=8.0，溶劑為無菌蒸餾水；優選為滅菌雙蒸水；

D、于步驟C所得上清液中加入0.1倍體積的3mol/LNaAc溶液及0.6倍體積的異丙醇溶液，沉淀至少2h，12000r/min、4℃離心5min，棄掉上清液；

E、于步驟D所得沉淀中加入預冷的70%乙醇500μL洗滌沉淀，12000r/min、4℃離心5min，棄掉上清液；

F、沉淀低溫真空干燥，即得真菌菌絲體DNA。