[發明專利]一種蟑螂過敏原制劑的質量控制方法

有效

• 申請號: 201410100108.8
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN103913578A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 何韶衡
• 申請（專利權）人: 安徽潤敏江生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;A61K39/35;A61P37/08
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技術領域

本發明涉及生物制藥技術領域，具體為一種蟑螂過敏原制劑的質量控制方法。

背景技術

過敏性疾病是二十一世紀人類四大非感染性重大疾病之一，發病率目前約占世界人口的22％，且逐年增加。我國面臨過敏性疾病防治的嚴峻形勢，研究解決過敏性疾病預防、診斷和治療技術問題，能滿足國民健康保障與國家經濟發展的重大需求。近年來特異性免疫治療(脫敏治療)在過敏性疾病治療中的作用得到了肯定，是該疾病唯一的對因治療方法。

建立過敏原國家參考品和標準檢定方法是實現中國全境過敏原標準化的必經之路。目前，已經有5種國際標準品(矮豚草、梯牧草、屋塵螨、樺樹、家犬，NIBSC保存)和1種國際參考試劑(百慕大草，ATCC保存)制定出來。FDA采用了建立過敏原制劑國家參考品、檢定方法、批放行標準的策略。自1990s后FDA開始著手建立自己的過敏原參考品、標準檢定方法以及批放行標準。相繼建立了一系列體外方法對過敏原成分、效價、含量進行鑒定，先后批準了19種標準化過敏原，并對全美過敏原生產商實行了統一、有效管理。歐盟發展了圍繞重組過敏原作為參考品、以夾心ELISA方法作為檢定方法的過敏原標準化策略。經過一系列候選標準的篩選，Bet?v1，Phl?p1，Phl?p5，0le?e1，Der?p1，Der?p2，Der?f1，Der?f2等8種主要過敏原的天然純化品和重組品都己得到了系統的研究，并建立了一套完善的結構、生物活性、定量方法等評價體系，以發展重組過敏原為候選參考品，確保重組過敏原與天然純化過敏原具有可比性以及臨床上的安全性、有效性、可控性。但是，我國尚無標準化過敏原參考品。

過敏原標準化是一項世界性難題，我國在此領域與歐美國家差距逐漸拉大。例如，美國為有效管理過敏原制劑，專門成立了FDA／CBER／LIB實驗室，旨在建立過敏原參考品、過敏患者參考血清池、標準的生物效價檢定方法、設定有效合理的質量放行標準。1981年，美國市場上有超過5000種非標準化過敏原產品出售，其中絕大部分均沒有安全性和有效性驗證。而現今，FDA經過多年過敏原標準化體系規范，正式批準的標準化過敏原僅19種。德國生物制品研究所一PEI研究所(Paul?Ehrlich?Institute，PEI)執行了同樣的策略，強制在德國推行標準化過敏原，加強監管，關閉了數十家過敏原生產企業。歐盟通過連續三屆框架科技計劃資助，建立了樺樹主要致敏蛋白重組參考品rBet?v1以及標準的ELISA檢定方法，準備寫入歐洲藥典。

發明內容

本發明所解決的技術問題在于提供一種蟑螂過敏原制劑的質量控制方法，以解決上述背景技術中的問題。

本發明所解決的技術問題采用以下技術方案來實現：一種蟑螂過敏原制劑的質量控制方法，包括如下步驟：

(1)蟑螂的標準化飼養：由3對純種美洲大蠊、3對純種德國小蠊分別在標準化條件下繁殖出公斤級蟑螂，從而保證原料的標準化，滅菌消毒后，在培養72小時條件下無細菌生長；

(2)蟑螂提取物含有5～10種主要致敏蛋白，1～5種次要過敏蛋白；

(3)檢測蟑螂提取物總蛋白量：蟑螂提取物在2mg／mL的濃度下使用考馬斯亮藍法檢測，使批間差異為0-40％；

(4)使用Western?blot法檢測蟑螂提取物主要過敏原蛋白間比例，使批間差異為0-40％；

(5)使用ELISA法，肥大細胞激發試驗檢測總生物效價，使批間差異為0-40％；

(6)檢測溶解性，5mg／nL蛋白無沉淀出現；

(7)加入的重組主要過敏原與提取物之間無沉淀反應；

(8)在培養72小時條件下無細菌生長；

(9)蟑螂提取物劑量在5mg／mL條件下，一周內無細胞毒性反應。

所述蟑螂提取物制作方法為蟑螂在-80℃冰箱中滅活；在手術顯微鏡下去除腸道；用75％乙醇清洗、浸泡15分鐘，風干后置于-80℃冰箱保存備用；取適量的冰凍蟑螂在液氮中研磨成粉末；丙酮脫脂2次后，置于-80℃冰箱中冷凍，隨后在真空冷凍干燥機內凍干成粉末；稱取蟑螂粉末1g，加入20L的提取液，在渦旋振蕩器上充分混勻，置4℃搖床上抽提0.5小時至4小時，之后在轉速為12000g，4℃條件下離心30min，吸取上清，即為蟑螂提取物。