[發(fā)明專利]重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410098355.9
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103882047A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊霞
• 申請（專利權(quán)）人: 太原錦波生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12;C12N15/10
• 代理公司: 太原科衛(wèi)專利事務(wù)所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源

1.重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，其步驟為：

①根據(jù)人酸性成纖維細胞生長因子haFGF全長序列設(shè)計引物克隆得到原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子從而獲得優(yōu)化的haFGF基因，所述優(yōu)化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；克隆得到分子伴侶PDI的原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子從而得到優(yōu)化的PDI基因，所述優(yōu)化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

②優(yōu)化的haFGF基因、優(yōu)化的PDI基因、標簽序列以及蛋白酶切位點序列連接后克隆進入載體，構(gòu)建得到高效表達載體；或是先構(gòu)建上述部分序列的備用載體，然后將其余序列連接于部分序列上，構(gòu)建得到高效表達載體；

③高效表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達；同時將含有相應(yīng)蛋白酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，一起誘導(dǎo)表達；隨后將兩種菌株以任意比例混合；

④用Tris緩沖液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整pH值，低溫振蕩使與蛋白酶切位點序列對應(yīng)的蛋白酶酶切完全，釋放出rhaFGF蛋白，得到高濃度的含有重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的溶液；

⑤將含有重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的溶液進行純化處理，得到高純度的rhaFGF蛋白，進行SDS-PAGE分析和含量測定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，步驟②中的標簽序列為六個連續(xù)的組氨酸標簽序列HIS₆，蛋白酶切位點序列為pp蛋白酶切位點序列，載體為pET-26b；步驟③中的相應(yīng)蛋白酶為pp蛋白酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，所述的步驟②為：優(yōu)化的haFGF基因3`末端增加HIS<sub>6</sub>，構(gòu)建得到基因片段haFGF-?HIS<sub>6</sub>；優(yōu)化的PDI基因5`末端加入pp蛋白酶切位點序列，構(gòu)建得到基因片段pp-PDI；然后將基因片段pp-PDI接到基因片段haFGF-?HIS₆的3`末端一起克隆進入pET-26b載體，構(gòu)建得到高效表達載體pET-26b-haFGF-?HIS₆-pp-PDI。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，所述的步驟②為：優(yōu)化的PDI基因5`末端加入pp蛋白酶切位點序列，構(gòu)建得到基因片段pp-PDI；基因片段pp-PDI克隆進入pET-26b載體，構(gòu)建得到pET-26b-?pp-PDI備用載體；優(yōu)化的haFGF基因3`末端增加HIS₆，構(gòu)建得到基因片段haFGF-?HIS₆；基因片段haFGF-?HIS₆克隆進入pET-26b-?pp-PDI備用載體，構(gòu)建得到高效表達載體pET-26b-haFGF-?HIS₆-pp-PDI。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一權(quán)利要求所述的重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，步驟③中haFGF重組蛋白菌株與蛋白酶菌株的質(zhì)量比為50:1。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一權(quán)利要求所述的重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法，其特征在于，步驟⑤中的純化處理為：將含有重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的溶液的pH值調(diào)整至8，然后上鎳離子親和柱，用Tris緩沖液上柱，15mM咪唑洗脫雜蛋白，250mM咪唑洗脫目的蛋白，透析過夜。