[發明專利]重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201410098355.9
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN103882047A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 楊霞
• 申請（專利權）人: 太原錦波生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12;C12N15/10
• 代理公司: 太原科衛專利事務所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源

技術領域

????本發明涉及基因工程領域重組蛋白的制備方法，具體是一種重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法。

背景技術

20世紀30年代，科學家就發現在人的大腦和垂體的組織提取物中存在一種能夠促進成纖維細胞生長的活性物質，到70年代，這種物質被分離提純。鑒于這種物質的作用，它被命名為成纖維細胞生長因子（fibroblast?growth?factor，FGF）。后來，又在多種器官組織中發現了這類因子，統稱為FGFs家族成員。不同的FGFs作為細胞間的信號分子在人胚胎發育和分化過程中起重要作用。迄今為止，共有大約23種人FGFs被發現。多數的FGFs在其N端具有信號肽幫助成熟蛋白分泌到胞外，但是某些FGFs成員缺乏信號肽，也能正常分泌到胞外。

FGF1也被稱為人酸性成纖維細胞生長因子(human?acidic?fibroblast?growth?factor，haFGF)，有廣泛促分裂的作用，主要分布于腦、垂體、神經組織、視網膜、腎上腺、心臟和骨骼等器官或組織內，其他組織含量很少，在血清和體液中以極低的濃度存在。人的haFGF基因位于第4號染色體上，為單拷貝基因，由兩個大的內含子和3個外顯子組成。haFGF蛋白由154個氨基酸殘基組成，等電點5～7，通過與其受體結合啟動信號轉導機制從而誘導多種細胞分化、增殖。

大量的研究表明，haFGF蛋白有刺激血管生長、加速創傷愈合和促進神經損傷修復等多種功能，外源性人酸性成纖維細胞生長因子蛋白有望成為臨床上用于促進傷口愈合、胃潰瘍、視神經萎縮、神經性耳聾、內臟缺血損傷等多種疾病治療的有效藥物。然而天然的haFGF蛋白含量很低，有必要開發基因工程重組haFGF，高效制備haFGF蛋白。

發明內容

本發明為了解決天然的haFGF含量很低不利于藥物開發的問題，提供了一種重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的制備方法，其步驟為：

①??根據人酸性成纖維細胞生長因子haFGF全長序列設計引物克隆得到原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子從而獲得優化的haFGF基因，所述優化的haFGF基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；克隆得到分子伴侶PDI的原始基因片段，并替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子從而得到優化的PDI基因，所述優化的PDI基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；

②??優化的haFGF基因、優化的PDI基因、標簽序列以及蛋白酶切位點序列連接后克隆進入載體，構建得到高效表達載體；或是先構建上述部分序列的備用載體，然后將其余序列連接于部分序列上，構建得到高效表達載體；

③??高效表達載體轉化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導重組基因的表達；同時將含有相應蛋白酶的質粒轉入Rosseta菌株，一起誘導表達；隨后將兩種菌株以任意比例混合；

④??用Tris緩沖液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液；調整pH值，低溫振蕩使與蛋白酶切位點序列對應的蛋白酶酶切完全，釋放出rhaFGF蛋白，得到高濃度的含有重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的溶液；

⑤將含有重組人酸性成纖維細胞生長因子蛋白的溶液進行純化處理，得到高純度的rhaFGF蛋白，進行SDS-PAGE分析和含量測定。

本發明中未詳細敘述“替換掉其中存在的大腸桿菌不利表達的密碼子”，由于基因優化密碼子的方法為本領域技術人員的公知常識，通常只需要給出最后優化后的全DNA序列即可，根據此序列本領域技術人員即可實現該方法的實現流程。

本發明中優化的PDI基因為分子伴侶，對于重組人酸性成纖維細胞生長因子的可溶性高效表達具有關鍵的輔助作用，與rhaFGF（重組haFGF）的相對位置是可變的。因此，步驟②中只要是載體上的優化的haFGF基因、優化的PDI基因、標簽序列以及蛋白酶切位點序列連接在一起，無論一次克隆進入載體或是分次克隆進入載體，任意變換它們在載體上的前后順序，均可實現haFGF的高效表達。且序列的連接以及克隆進入載體均是本領域公知常識，本發明不作過多的闡述。

本發明步驟②中的標簽序列除了采用本發明提到的六個連續的組氨酸標簽序列HIS₆，還可采用本領域常用的其它標簽序列，例如Flag標簽，HA標簽，GST標簽等等。