[發(fā)明專利]一種重組人細(xì)小病毒B19蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410098047.6
• 申請日: 2014-03-17
• 公開（公告）號: CN103849630A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曉剛;張秀杰;華艷
• 申請（專利權(quán)）人: 北京英諾特生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/35
• 分類號: C12N15/35;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/015;G01N33/68;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 呂世靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程、疫苗研制和診斷試劑等領(lǐng)域，具體地涉及一種人細(xì)小病毒B19蛋白及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

1975年Cossat等人從1個無癥狀健康供血員血清標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)直徑為20-25nm球形病毒顆粒，編定為B19病毒。經(jīng)基因和生化分析，該病毒屬細(xì)小病毒屬，稱人細(xì)小病毒B19（Human?Parvovirus?B19，以下簡稱B19病毒）。B19病毒是目前細(xì)小病毒家族中除人博卡病毒（HBoV）和新型細(xì)小病毒PARV4（Human?parvovirus4）以外唯一可以引起人類疾病的病毒。它可能是多種疾病的致病因子，感染兒童可引起傳染性紅斑，感染成人可引起多發(fā)性關(guān)節(jié)病綜合征，而對一些有免疫病和血液病的患者，B19感染可以引起嚴(yán)重的疾病，如慢性紅細(xì)胞貧血，再生障礙性貧血危象。?

1986年，Shade等首次發(fā)表了B19病毒近全長的基因組核昔酸序列。B19病毒是一種直徑約為20～25nm的無包膜單鏈線狀DNA病毒，B19病毒基因組全長5.6Kb，其兩端均有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，各由383個堿基組成，非結(jié)構(gòu)蛋白NS1編碼區(qū)基因組左半側(cè)，且相互重疊，VP2基因位于VP1基因內(nèi)。B19病毒感染細(xì)胞后，共產(chǎn)生9種mRNA，其中5種與特異性蛋白有關(guān)。兩種編碼較大的結(jié)構(gòu)蛋白VP1（85×10³），兩種編碼較小的結(jié)構(gòu)蛋白VP2(55×10³)，另一種則編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(77×10³)。病毒衣殼的95%由VP2蛋白組成，VP1僅占5%。VP1除N端增加的227個氨基酸外，其余部分均與VP2相同。病毒的大部分中和抗原位于VPl獨(dú)特區(qū)和VP1-VP2連接區(qū)，機(jī)體感染該病毒后的中和性抗體主要針對該部位產(chǎn)生。?

序列同源性分析及DNA雜交結(jié)果表明，雖然細(xì)小病毒屬的多數(shù)?成員間核昔酸序列同源性很高，但是B19病毒與其它細(xì)小病毒的基因組序列同源性卻很低。經(jīng)多年研究，認(rèn)為不同來源的B19病毒毒株之間的基因變異比丙型肝炎等具有顯著異性源有高度可變性的病毒小得多，但是該病毒仍具有多個明顯不同的基因型。?

由于細(xì)小病毒B19致病的廣泛性和復(fù)雜性，目前，國際上對該病毒的研究比較活躍。如人類免疫缺陷病毒(艾滋病病毒)、丙型肝炎病毒和幽門螺桿菌一樣，B19亦被認(rèn)為是當(dāng)代醫(yī)學(xué)史上新發(fā)現(xiàn)的與人類疾病密切相關(guān)的重要致病因子。?

目前血清學(xué)檢測包括B19抗體和抗原的檢測。其中，抗體檢測是目前臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查B19感染的主要方法。檢測B19病毒抗體起初是采用血源抗原，但該抗原來源困難，難丁普及和推廣。目前應(yīng)用重組技術(shù)表達(dá)B19病毒結(jié)構(gòu)蛋白制備的基因工程抗原，已應(yīng)用于B19抗體檢測，并在不斷改進(jìn)和完善。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種重組人細(xì)小病毒B19蛋白，本發(fā)明的另一目的是提供該重組人細(xì)小病毒B19蛋白在制備檢測試劑盒中的應(yīng)用。?

本發(fā)明提供了一種編碼人細(xì)小病毒B19蛋白的重組DNA，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。同時提供了由該重組DNA序列編碼的人細(xì)小病毒B19蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?

本發(fā)明還提供了一種人細(xì)小病毒B19蛋白的表達(dá)載體pET-21a-B19，它是將SEQ?ID?NO.1所示所述的重組DNA序列插入到質(zhì)粒pET-21a上得到的重組質(zhì)粒，其質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。將表達(dá)載體pET-21a-B19導(dǎo)入大腸桿菌中，得到表達(dá)人細(xì)小病毒B19蛋白的工程菌株，該菌株于2014年03月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCCNo.?8893。?

本發(fā)明利用SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列通過基因工程方法制備人細(xì)小病毒B19蛋白可以通過如下步驟實現(xiàn)：?

1）獲得具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列；?

2）將該核苷酸序列導(dǎo)入質(zhì)粒，優(yōu)選pET-21a質(zhì)粒；?

3）將該質(zhì)粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌宿主細(xì)胞，更優(yōu)選BL21（DE3）菌株中；?

4）在有利于所述核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；?

5）回收、純化及復(fù)性所表達(dá)的重組蛋白。?

上述步驟4）的培養(yǎng)條件為：37℃培養(yǎng)3小時后（轉(zhuǎn)速200r/min），加入誘導(dǎo)劑（終濃度為1mmol/mL），37℃誘導(dǎo)表達(dá)5小時（轉(zhuǎn)速200r/min）。?