[發明專利]一種酮還原酶突變體及其制備和應用

有效

• 申請號: 201410097433.3
• 申請日: 2014-03-17
• 公開（公告）號: CN104928265B
• 公開（公告）日: 2018-01-02
• 發明（設計）人: 陳峻青;石利平;尹曉龍;王清
• 申請（專利權）人: 江蘇阿爾法藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12P17/12;C12R1/19;C12R1/865;C12R1/84
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,徐冬濤

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種酮還原酶突變體及其制備和應用。

背景技術

孟魯司特(Montelukast)，商品名順爾寧(Singulair)，化學名為[R-(E)]-1-[[[1-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-[2-(1-羥基-1甲基乙基)苯基]丙基]硫代]甲基]環丙基乙酸鈉，是由默克公司研制開發的一種高選擇性半胱氨酞白三烯(Cys-LT)受體拮抗劑，它能競爭性拮抗白三烯D₄與Cys-LT1受體的結合，是治療阿司匹林過敏性哮喘和運動性哮喘的最優選擇。孟魯司特不僅可以改善哮喘患者的肺功能，而且在抗炎、免疫等諸多方面也有重要的應用價值，具有廣闊的應用前景。(S,E)-甲基-2-[3-[3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸叔丁酯(分子式C₂₈H₂₄NO₃Cl，分子量457.96，CAS號142569-69-5)，是合成孟魯司特鈉(順耳寧Singulair)的關鍵中間體。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種催化活性高、對映選擇性好的酮還原酶突變體基因，及其編碼的酮還原酶突變體，含有該基因的重組表達載體、基因工程菌及其制備方法，以及該酮還原酶突變體在催化還原其他酮類底物中的應用。特別的，將該酮還原酶突變體用于不對稱還原酮類化合物的生產中。

本發明提供一種酮還原酶突變體基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者由SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列經過取代、缺失或者添加一個或者幾個核苷酸且具有酮還原酶活性的由(1)衍生的基因。

本發明提供一種高活性的酮還原酶突變體，其是(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列組成的蛋白質；(2)或是由SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸且具有酮還原酶活性的由(1)衍生的蛋白質。

本發明的另一目的在于提供一種包含所述的的酮還原酶突變體基因的重組表達載體。其可通過本領域常規方法將本發明的酮還原酶突變體基因的核苷酸序列連接于各種載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種載體，優選pUC19。

本發明的另一目的在于提供一種包含本發明的重組酮還原酶基因或其重組表達載體的基因工程菌，本發明優選大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。將前述重組表達質粒轉化至大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本發明優選的基因工程菌。

本發明的另一目的在于提供一種利用該基因工程菌制備酮還原酶突變體的方法，包括構建該基因工程菌；篩選得到該基因工程菌；發酵培養該基因工程菌；以及收集和制備酮還原酶突變體。

本發明的另一個目的在于將由基因工程菌生產出的酮還原酶突變體應用到不對稱還原酮類化合物以制備光學活性手性醇。

根據本發明提供的該基因工程菌的應用，其中，底物的結構式為：

有益效果：

本發明通過化學、分子生物學、生物信息學及高通量篩選方法，開發了一個具有較高特異性(對映體過量值>99.9％)及較好催化活性的重組酮還原酶，并將其與甲酸脫氫酶(FDH)及NADH共同使用，用于不對稱還原2-[3-[3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯以制備(S,E)-甲基-2-[3-[3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸叔丁酯。甲酸/甲酸脫氫酶是成功的輔酶再生體系，此反應產生的副產物CO₂對任何酶的活性均沒有影響，底物甲酸價格低廉，且很多酶對甲酸有很高的耐受性。本發明的反應條件溫和：常溫、常壓、中性或接近中性pH，設備要求不高，投入資金相對較少，且反應轉化率高、對映體選擇性高。

附圖說明

圖1本發明酮還原酶突變體催化不對稱還原酮類化合物以制備光學活性手性醇的反應原理圖。

生物材料保藏信息

大腸桿菌BL21(DE3)KRED1306(Escherichia coli BL21(DE3)KRED1306)，已于2014年3月14日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO：M2014078。

具體實施方式