[發明專利]鑒定芥藍齊口期DNA甲基化基因的方法

有效

• 申請號: 201410096563.5
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103898212A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 史衛東;康紅衛;羅海玲;琚茜茜;馮誠誠
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院蔬菜研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于基因鑒定分離技術領域，尤其涉及一種芥藍菜齊口期DNA甲基化相關基因的鑒定和分離方法。?

背景技術

芥藍（Brassica?oleracea?L.var.alboglabra?Bailey）是起源于我國的著名特產蔬菜之一，主產區有廣東、廣西、福建和臺灣等省區，沿海及北方大城市郊區也有少量栽培。芥藍產量器官是花莖，即菜薹，幼苗及葉片也可食用。芥藍以秋冬生產為主，以9月至豎年3月為主要栽培季節，產品供應時間較長。收獲期是齊口期，即開花始期，植株正經歷從營養生長向生殖生長的轉換，是菜薹發育到滿足商品性要求的時期，生產上常作為品種分類標準，直接反映了許多重要的生物學特性。?

芥藍性喜冷涼而惡炎熱，對溫光周期的要求不嚴格，通過低溫春化階段后便能順利開花。DNA甲基化是基因組DNA主要的一種表觀遺傳修飾，是指不因DNA序列的變化而形成的基因功能的改變，這種改變又可隨細胞的有絲分裂和(或)減數分裂遺傳，是調節基因功能的重要手段。胞嘧啶甲基化有2個方面的功能，即保護基因組不受自私DNA元件的干擾和調節基因表達。春化作用通過DNA甲基化水平的變化改變關鍵基因的表達，利用去甲基化試劑誘導植物在非春化處理條件下開花，發現DNA甲基化能夠阻止某些開花基因的表達，低溫春化是通過去甲基化使某些基因轉錄而誘導開花，認為春化作用的分子基礎是DNA的去甲基化。有試驗證實僅DNA甲基化水平降低就足以誘導開花，去甲基化和低溫促進開花的效果具有加成性，說明春化作用有許多特性可以通過控制開花的關鍵基因的去甲基化假說解釋。在模式植物擬南芥上基因組DNA甲基化可以引起表型異常，這種表觀遺傳變異可占擬南芥株高和開花時間表型變異的30%，但不同生態型的甲基化調控機制各異，導致基因型之間的甲基化多態性不相關，并且DNA甲基化水平降低誘導的表型在基因型之間變化很大，僅弱相關于親緣關系。?

檢測甲基化的方法有很多，而基于AFLP技術建立的甲基化敏感擴增多態性法(methylation?sensitive?amplified?polymorphism，MSAP)能夠分析全基因組的甲基化水平、基因組或染色體的特定區域的甲基化水平、比較不同材料或組織及同一組織不同發育時期之間的甲基化差異。其原理是利用兩個對DNA甲基化敏感性不同的同裂酶HpalI和MspI，分別切割基因組DNA，產生不同的酶切產物，將酶切產物添加接頭，然后進行PCR?擴增，PAGE電泳，銀染，在不同泳道相對應的位置上能夠產生可見的具有不同酶切型式的譜帶。如要進一步了解甲基化的DNA序列信息，可對差異條帶進行切膠回收、克隆、測序，采用BLAST工具軟件與NCBI等數據庫序列相似性比較，便可得知發生胞嘧啶甲基化變化后的具體位置和甲基化片段在基因組上的分布規律。其優點如下：(1)不需知道被測DNA的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于DNA序列背景知識未知的生物。(2)操作相對簡便，在AFLP技術體系的基礎無需改進，即可操作。(3)可在全基因組范圍檢測CCGG位點的胞嘧啶甲基化變化。(4)無需大型儀器，成本低，效率高，技術簡單。(5)甲基化位點序列可以直接與公共數據庫比對，直接鑒定出甲基化的基因信息，是研究基因表達與DNA甲基化關系最有效的方法，已經廣泛應用于真菌、擬南芥、白菜、水稻、油菜及辣椒等植物研究。?

目前僅見利用MSAP分析芥藍齊口期DNA甲基化多態性的研究，但分離和克隆齊口期DNA甲基化相關基因的研究還未見報道。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種芥藍菜齊口期DNA甲基化相關基因的鑒定和分離方法。?

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：芥藍菜齊口期DNA甲基化相關基因的鑒定和分離方法，通過分期播種不同熟性的芥藍，調查齊口期變化，然后利用MSAP（甲基化敏感擴增多態性法）分析齊口期DNA甲基化水平變化，從而鑒定和分離DNA甲基化相關基因。?

分期播種是指分期秋播和春播，秋播包括早秋播、中秋播和晚秋播三期，春播包括早春播、仲春播和晚春播三期；不同熟性的芥藍包括早熟生態型的尖葉夏芥藍、中熟生態型的中花芥藍和晚熟生態型的遲花芥蘭。?

上述芥藍菜齊口期DNA甲基化相關基因的鑒定和分離方法，包括以下步驟：?

<1>分期播種三種熟性芥藍?

選用早、中、晚3個生態型芥藍品種尖葉夏芥藍、中花芥藍和遲花芥蘭，通過早秋播、中秋播、晚秋播和早春播、仲春播和晚春播6個處理，創造齊口期變化；?