[發(fā)明專利]鑒定芥藍齊口期DNA甲基化基因的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410096563.5
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN103898212A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 史衛(wèi)東;康紅衛(wèi);羅海玲;琚茜茜;馮誠誠
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種芥藍菜齊口期DNA甲基化相關(guān)基因的鑒定和分離方法，其特征在于：通過分期播種不同熟性的芥藍，調(diào)查齊口期變化，然后利用MSAP分析齊口期DNA甲基化水平變化，從而鑒定和分離DNA甲基化相關(guān)基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芥藍菜齊口期DNA甲基化相關(guān)基因的鑒定和分離方法，其特征在于：所述分期播種是指分期秋播和春播，秋播包括早秋播、中秋播和晚秋播三期，春播包括早春播、仲春播和晚春播三期；所述不同熟性的芥藍包括早熟生態(tài)型的尖葉夏芥藍、中熟生態(tài)型的中花芥藍和晚熟生態(tài)型的遲花芥蘭。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的芥藍菜齊口期DNA甲基化相關(guān)基因的鑒定和分離方法，其特征在于包括以下步驟：

<1>分期播種三種熟性芥藍

選用早、中、晚3個生態(tài)型芥藍品種尖葉夏芥藍、中花芥藍和遲花芥蘭，通過早秋播、中秋播、晚秋播和早春播、仲春播和晚春播6個處理，創(chuàng)造齊口期變化；

<2>提取DNA

分別提取步驟<1>中三種生態(tài)型芥藍品種在6個處理下的DNA；

<3>MSAP分析

步驟<2>中各處理基因組DNA分別用兩對限制性內(nèi)切酶EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI進行酶切并同時進行連接反應；取5μL酶切連接產(chǎn)物進行預擴增反應，將預擴增PCR產(chǎn)物稀釋30倍后用做選擇性擴增底物；選擇性擴增產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，硝酸銀染色；

<4>數(shù)據(jù)分析。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芥藍菜齊口期DNA甲基化相關(guān)基因的鑒定和分離方法，其特征在于所述提取DNA按以下操作進行：取0.5g左右芥藍葉片，加液氮研磨，分別加入800μL的CTAB和10μL的巰基乙醇，65℃水浴45min；4℃，12000rpm離心10min，取上清液到另一2mL離心管中，加入等體積的體積比24:1的氯仿-異戊醇混合液，抽提2次后，4℃離心，12000rpm，10min；取上清液到1.5mL離心管中，加入等體積冷異丙醇與1/10體積NaAC，4℃沉淀30min；棄上清液，加入100μl的純水溶解，加1.5μlRNA酶，37℃溫浴4h，再加入與上清液等體積的體積比25:24:1的酚-氯仿-異戊醇進行純化，得到的樣品DNA用1xTAE稀釋成50ng/μL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芥藍菜齊口期DNA甲基化相關(guān)基因的鑒定和分離方法，其特征在于所述酶切和連接按以下操作進行：將酶切連接反應體系置于37℃保溫過夜，然后65℃滅活10min并用ddH₂O稀釋10倍作為預擴增的底物；酶切和連接體系為50μL：400ng?DNA，5U?EcoR?I，10U?Hpa1I或MspI，2U?T₄DNA連接酶，5pmol?EcoRI接頭，2pmol?HpaII/MspI接頭，1×反應緩沖液。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芥藍菜齊口期DNA甲基化相關(guān)基因的鑒定和分離方法，其特征在于所述預擴增按以下操作進行：反應體系為20μL：3μl酶切連接產(chǎn)物，10×buffer，2mmol/L?Mg²⁺，0.2mmol/L?dNTP，0.05U/μl?TaqDNA聚合酶，0.5μmol/L?MseI和EcoRI引物；反應條件：94℃3min；94℃變性30S，56℃30S，72℃1min，25個循環(huán)；72℃7min；4℃保存。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芥藍菜齊口期DNA甲基化相關(guān)基因的鑒定和分離方法，其特征在于所述選擇性擴增按以下操作進行：反應體系為20μL：5μL預擴增反應稀釋產(chǎn)物，10x?PCR?Buffer，2mmol/L?Mg²⁺，0.5μmol/L?EcoRI和HpaII/MspI引物，0.2mmol/LdNTP，0.05U/μl?TaqDNA聚合酶；反應條件為：94℃5min；94℃30S，65℃30S、-0.7℃每個循環(huán)，72℃lmin，13個循環(huán)；94℃30S，56℃30S，72℃lmin，24個循環(huán)；72℃7min；4℃保存。