[發(fā)明專利]基于焦磷酸測(cè)序的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌已胺丁醇耐藥性的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410096084.3
• 申請(qǐng)日: 2014-03-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103866024A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳曉光;程琳;郭寧;張瑾;姜華;金燕;梁潔;張娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;邱岳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的方法，具體是一種基于焦磷酸測(cè)序的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌已胺丁醇耐藥性的方法。?

背景技術(shù)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，是目前傳染病中威脅人類健康的頭號(hào)殺手。耐藥結(jié)核菌株的產(chǎn)生和播散，尤其是耐多藥菌株的出現(xiàn)，已成為新世紀(jì)結(jié)核病控制的三大難題之一。快速準(zhǔn)確的耐多藥結(jié)核病的檢測(cè)對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)、阻斷耐藥結(jié)核病的傳播，規(guī)范指導(dǎo)用藥，提高耐藥結(jié)核病的治愈率具有非常重要的意義。?

結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢,傳統(tǒng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)方法主要以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的絕對(duì)濃度法或比例法，因不能及時(shí)確定藥物的耐藥性,可導(dǎo)致多重耐藥發(fā)生,以及耐藥結(jié)核的傳播。已報(bào)道的藥敏基因檢測(cè)方法如傳統(tǒng)測(cè)序法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法、RNA/RNA錯(cuò)配法、線性探針雜交法、異源雙鏈形成分析法和基因芯片法，多數(shù)存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)過(guò)程繁瑣且不能精確確定突變位置及突變類型等缺點(diǎn)。?

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一種新型DNA測(cè)序技術(shù)，與作為分子藥敏金標(biāo)準(zhǔn)的Sanger測(cè)序法相比，無(wú)需對(duì)整個(gè)基因進(jìn)行測(cè)定，只需對(duì)特定短片段進(jìn)行測(cè)序即可檢測(cè)到所有類型的突變，趙錦榮等用此法在結(jié)核菌利福平耐藥決定區(qū)突變檢測(cè)中取得良好的效果,目前用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)已胺丁醇耐藥性還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。?

藥物乙胺丁醇(EMB)是具有廣譜抗分支桿菌活性的一線抗結(jié)核合成藥物，被廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等引起的結(jié)核的治療，具有比異煙肼更廣的抗菌譜。embB基因全長(zhǎng)約3246bp,編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶,embB基因突變使阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,影響其與EMB的相互作用,使EMB失去作用靶分子或結(jié)合力降低而失去作用,導(dǎo)致耐EMB的產(chǎn)生。?

研究表明結(jié)核EMB耐藥主要由embB基因306位點(diǎn)(embB306)的突變引起。長(zhǎng)期以來(lái)embB306突變一直被視為結(jié)核分枝桿菌耐已胺丁醇(EMB)的分子診斷標(biāo)記。但是，最近研究發(fā)現(xiàn)，embB306突變并不特異性地引起結(jié)核分枝桿菌EMB耐藥性，而是容易產(chǎn)生對(duì)任何藥物的耐藥性，檢測(cè)embB306基因突變可作為耐多藥結(jié)核病的標(biāo)志。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于焦磷酸測(cè)序的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌已胺丁醇耐藥性的方法，通過(guò)檢測(cè)其embB基因306位點(diǎn)的變異，判斷結(jié)核桿菌耐多藥性，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，并有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)感染MDR.TB以及其他多耐藥結(jié)核分枝桿菌患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療。?

本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思如下：?

由于embB基因的突變主要集中于306位點(diǎn)，本發(fā)明主要針對(duì)乙胺丁醇耐藥基因306位點(diǎn)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序檢測(cè)。?

先對(duì)embB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，判斷embB基因是否具有突變；其中焦磷酸測(cè)序采用序列分析模式（Sequence?Analysis，SQA）SQA模式、核苷酸加樣順序?yàn)锳GCT。?

本發(fā)明的主要原理為:?

焦磷酸測(cè)序技術(shù)?

1)焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）技術(shù)是全新的一種DNA序列分析技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確地測(cè)定一段較短的目標(biāo)片段。該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便。?

2)焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，基本原理如下：將1個(gè)特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物（包括DNA?Polymerase、ATP?Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3’末端，同時(shí)釋放出摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見(jiàn)光。通過(guò)CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。加入另一種dNTP，使第2～4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。?