[發明專利]基于焦磷酸測序的檢測結核分枝桿菌已胺丁醇耐藥性的方法

在審

• 申請號: 201410096084.3
• 申請日: 2014-03-16
• 公開（公告）號: CN103866024A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 陳曉光;程琳;郭寧;張瑾;姜華;金燕;梁潔;張娟
• 申請（專利權）人: 山東國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;邱岳

1.基于焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌已胺丁醇耐藥性的方法，其特征在于包括以下順序步驟：

步驟1，對embB基因進行PCR擴增；包括針對embB基因306位點設計PCR擴增引物，以標本結核桿菌DNA提取物為模板，對embB基因進行PCR擴增，

擴增使用的PCR引物在embB基因306位點序列是高度保守和唯一的，擴增結核分枝桿菌embB基因的DNA片段長度為165bp，包含embB基因306位點序列:atg

所用的擴增embB基因的PCR引物及其序列如下：

F:CGTGGTGATATTCGGCTTCCT

R:AGGTTGTAATACCAGCCGAAGG

其中F引物5端用生物素標記；F為PCR上游引物；R為PCR下游引物。

步驟2，對PCR擴增產物進行焦磷酸測序，判斷embB基因306位點是否具有突變；其中焦磷酸測序采用SQA模式、核苷酸加樣順序為AGCT；

所述焦磷酸測序檢測步驟具體如下

（1）PCR產物固定：在PCR板中放入40μL的PCR擴增產物，再分別加入36μL的結合緩沖液和4μL鏈親和素包被的磁珠；將PCR板放在渦旋振蕩器上常溫振蕩20分鐘，使PCR產物固定在磁珠上；

（2）單鏈模板的純化：打開真空泵，將真空樣品轉移器移到PCR板中，抓取結合PCR產物的磁珠，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空樣品轉移器上；再將真空樣品轉移器放入70%乙醇中輕微振蕩5秒，然后移到變性緩沖液中抽吸5秒，使DNA變性以得到純化的單鏈DNA模板，最后移到洗滌緩沖液中清洗5-10秒，洗滌未固定的單鏈DNA，從而得到作為測序模板的單鏈DNA；

（3）引物雜交：先在焦磷酸測序微孔板各孔中加入退火緩沖液50μL，再加入具有表1所示序列測序引物；測序引物的最低要求濃度為1μmol/L，最高濃度為0.2mmol/L；再將真空樣品轉移器從PCR板移入焦磷酸測序微孔板，關閉真空泵，將已純化好的單鏈DNA模板與序列測序物引物混和，在80℃下變性2分鐘，然后冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交；

測序引物的序列如下所示：

GTGGTCGGCGACTCG

（4）焦磷酸測序：依次在測序儀試劑倉中加入酶、底物和4種dNTPs，選用SQA檢測模式、以A、G、C、T順序循環加樣16次的堿基加入順序進行測序反應；通過CCD光學系統對每次加樣后產物進行檢測，以獲得特異的檢測峰，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息；

（5）將焦磷酸測序結果與結核分枝桿菌標準株的embB基因306位點序列相比較，即可準確的判斷出結核分枝桿菌embB基因306位點是否發生耐藥突變，embB306突變被視為結核分枝桿菌耐已胺丁醇(EMB)和耐多藥結核病的分子診斷標記，進一步判斷檢測結核分枝桿菌具有耐已胺丁醇(EMB)和耐多藥性。

2.如權利要求1所述的基于焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥性的方法，其特征在于在50μL反應體系中，其中所述PCR引物的濃度為50nmol/L。

3.如權利要求1所述的基于焦磷酸測序技術檢測結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥性的方法，其特征在于所述的擴增反應過程包括下列順序步驟：

步驟1：在95℃下進行預熱2分鐘；

步驟2：在95℃下保持15秒進行變性、59℃下保持15秒進行退火、72℃下保持15秒進行擴增和延伸，循環退火過程36次；

步驟3：在72℃下保持7分鐘。