[發明專利]重組型凝血酶原的制造方法、載體DNA及試劑盒

有效

• 申請號: 201410095588.3
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN104046606B
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發明（設計）人: 坂東孝彥;菅井睦美
• 申請（專利權）人: 希森美康株式會社
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74;C12N15/866;C12Q1/56
• 代理公司: 11038 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李英

本發明提供重組型凝血酶原的制造方法。所述制造方法包括提供整合有編碼選自MBP、SUMO及NusA的標簽的基因和編碼凝血酶原的基因的載體DNA的步驟、及在鱗翅目昆蟲或上述鱗翅目昆蟲的培養細胞中表達融合有標簽的凝血酶原的步驟。

【技術領域】

本發明涉及重組型凝血酶原的制造方法、載體DNA及試劑盒。

【背景技術】

凝血酶原是在肝臟產生的分子量約72,000的凝血酶前體蛋白質，也被稱為血液凝固第II因子。凝血酶原，在活體內，被活化第X因子、活化第V因子、磷脂及鈣離子的復合物限制性分解，轉變為凝血酶。凝血酶是在血液凝固反應中將纖維蛋白原限制性分解而生成纖維蛋白的絲氨酸蛋白酶，是與止血或創傷治愈等相關的重要的蛋白質。因此，凝血酶不僅在臨床領域用作止血劑或血液檢查用試劑，還在分子生物學領域等中用作研究用試劑。

凝血酶在血漿中大量存在，因此制劑或試劑用凝血酶主要以人或牛的血漿作為原料制備。但是，在這些的原料中有混入肝炎病毒或人免疫缺陷病毒、異常朊病毒等的感染性物質的危險性。另外，由于血漿是天然來源原料，所以制品的批間差異成為問題。

因此，近年研究－開發了從由利用大腸桿菌或哺乳動物細胞的基因重組技術制備的凝血酶原或前凝血酶制造凝血酶的方法（特開2002-306163、US2004/197858、US2009/137001）。

【發明內容】

本發明的范圍僅由隨附的權利要求定義，且不受此發明概述部分的任何限制。

將凝血酶原或前凝血酶用大腸桿菌表達時，已知其幾乎全部成為被稱為包涵體的不溶性凝集體。從而，將回收的不溶性凝集體用變性劑使之可溶之后，有必要進行重折疊處理。但是，已知重折疊處理不僅煩瑣，而且如凝血酶原或前凝血酶這樣的復雜結構的蛋白質的重折疊效率極其低下。另外，擔心用從通過重折疊處理而可溶的凝血酶前體得到的凝血酶的比活性（每單位重量的活性）低。例如，在SoejimaK等人（J.Biochem.vol.130，p.269-277,2001）中記載了從由大腸桿菌表達系統得到的前凝血酶2制備凝血酶，顯示通過重折疊處理而可溶的蛋白質之中有4～7%左右為有酶活性的凝血酶。即，從通過重折疊處理而可溶的凝血酶前體得到的凝血酶的比活性是血漿來源的天然型凝血酶的4～7%左右。

利用哺乳動物細胞的表達系統時可得到可溶性的凝血酶原或前凝血酶，但從工業規模制造的觀點來看，存在產量非常少，另外制造成本也高的問題。

另一方面，用利用大腸桿菌或哺乳動物細胞的表達系統可表達向希望得到的蛋白質融合了功能性標簽蛋白質的重組型蛋白質。例如，作為重組型蛋白質的純化用標簽，有6×His標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）標簽、FLAG標簽、麥芽糖結合蛋白質（MBP）標簽等。另外，近年開發了提高重組型蛋白質的表達量或可溶性的標簽蛋白質。例如，已知MBP標簽或低分子泛素樣修飾因子（SUMO）標簽等是提高蛋白質的可溶性的標簽，在利用大腸桿菌或酵母的表達系統中，重組型蛋白質的可溶性得到改善（US2009/305342，US2007/037246）。

但是，已知存在下述情況：即使融合有可溶性標簽的蛋白質整體保持可溶性，但目的蛋白質部分不能形成正確的構象，進而該蛋白質不具有原本的活性。這樣一來，通過融合可溶性標簽而看起來成為可溶性的重組型蛋白質，存在一旦切斷可溶性標簽，就成為不溶性凝集體或失去活性的情況。

鑒于如上述一樣的情況，本發明人等以提供滿足下述兩方面條件的重組型凝血酶原的制造方法為課題：可簡便并且大量地制造可溶性的凝血酶原，和從得到的凝血酶原轉變的凝血酶有高的比活性。

本發明人經銳意探索，結果發現通過將融合有特定標簽的凝血酶原在利用鱗翅目昆蟲的表達系統中表達，可簡便并且大量地得到可溶性的凝血酶原，從得到的凝血酶原轉變的凝血酶有高的比活性，從而完成本發明。