[發明專利]用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法

有效

• 申請號: 201410094933.1
• 申請日: 2014-03-16
• 公開（公告）號: CN103808681B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 劉彤;陳歡;韓書磊;吳帥賓;付立偉;張小濤;石龍凱;侯宏衛;胡清源
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

1.一種用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法，其特征在于：包括以下步驟：?

1）溶液的制備：

（1）中性紅染液：0.2?g中性紅加雙蒸水至100?ml，過濾除菌并用細胞培養基稀釋至50?μg/ml；

（2）中性紅萃取液：冰醋酸∶無水乙醇∶水＝1∶50∶49；

（3）陽性對照：十二烷基硫酸鈉（SDS），200?μg/ml，100%?細胞致死率濃度；

（4）電子煙煙液染毒溶液：使用分析天平對電子煙煙彈液進行準確稱量，然后使用細胞培養基溶液稀釋配制；

2）細胞樣本的處理：

（1）細胞接種：選用人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞，向96孔板的每孔中加入100?μL的BEAS-2B細胞懸液；

（2）電子煙煙液染毒：細胞培養24?h后，吸去培養液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔為一組分別設置為陰性對照組、8個不同劑量的電子煙煙液染毒組和陽性對照組，陰性對照組每孔加入?100μl細胞培養基、電子煙煙液染毒組每孔加入100μl電子煙染毒溶液、陽性對照組每孔加入200μg/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100μl稀釋培養液作為溶劑背景對照，于37?℃、5%?CO₂?條件下培養24?h；

（3）中性紅染色：電子煙煙液染毒24?h后，吸去培養液，每孔加入100?μl中性紅染液，于37?℃、5%?CO₂?條件下培養3?h，3?h后取出96孔板，吸去中性紅染液，每孔加入200?μlPBS洗2次，加入100ul中性紅萃取液，室溫下快速振蕩15-20?min，使用酶標儀檢測540?nm波長處的吸光煙液值；

（4）結果與分析：計算相對吸光值，相對吸光值代表細胞存活率，相對吸光值C=?A₅₄₀/?A_{540陰性對照}；

此外，所用SDS陽性對照為100%細胞致死濃度，故A_{540陽性對照}應小于等于0.3。

2.根據權利要求1所述的用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法，其特征在于：人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞最佳接種密度為20000個/孔。

3.根據權利要求1所述的用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法，其特征在于：電子煙煙液細胞毒性濃度的染毒區間應包含5mg/ml至60?mg/ml范圍。