[發(fā)明專(zhuān)利]用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410094933.1
• 申請(qǐng)日: 2014-03-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103808681B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉彤;陳歡;韓書(shū)磊;吳帥賓;付立偉;張小濤;石龍凱;侯宏衛(wèi);胡清源
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 代理公司: 鄭州中民專(zhuān)利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及電子煙煙液體外細(xì)胞毒性的測(cè)定，具體說(shuō)是基于中性紅染料分析電子煙煙液染毒后細(xì)胞存活率的定量測(cè)定方法。

背景技術(shù)

隨著人們對(duì)“吸煙有害健康”的了解，各國(guó)政府均在現(xiàn)行法律規(guī)定范圍內(nèi)積極采取和實(shí)行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共場(chǎng)所吸煙。2005年，中國(guó)簽署了世界衛(wèi)生組織《煙草控制框架公約》。2012年，中國(guó)政府發(fā)布《中國(guó)煙草控制規(guī)劃（2012-2015年）》，提出創(chuàng)造無(wú)煙環(huán)境，實(shí)施公共場(chǎng)所全面禁煙。室內(nèi)禁煙措施導(dǎo)致電子煙等新型產(chǎn)品在各國(guó)市場(chǎng)上得到迅速增長(zhǎng)，消費(fèi)群體不斷擴(kuò)大。電子煙又名電子尼古丁傳送系統(tǒng)。世界衛(wèi)生組織對(duì)電子尼古丁傳送系統(tǒng)的官方定義為：電子尼古丁傳送系統(tǒng)是一種消費(fèi)產(chǎn)品，能夠向肺傳輸尼古丁。電子煙一般都由三部分構(gòu)成：煙桿、霧化器、煙液。近年來(lái)，電子煙以“保健”，“戒煙”，“清肺”等為宣傳口號(hào)，以網(wǎng)絡(luò)為主要營(yíng)銷(xiāo)途徑，在中國(guó)地區(qū)銷(xiāo)量大增。某些電子煙產(chǎn)品還宣稱(chēng)其比傳統(tǒng)卷煙的危害性更小。然而目前對(duì)電子煙的毒性評(píng)價(jià)研究較少，相關(guān)研究?jī)H使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法（MTT法）對(duì)電子煙煙液或煙霧的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明不同電子煙煙液的細(xì)胞毒性相差很大。

檢測(cè)化合物細(xì)胞毒性可通過(guò)多種生物學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行，例如通過(guò)測(cè)定酸性磷酸酶或其他蛋白活性來(lái)計(jì)算細(xì)胞數(shù)量、測(cè)定細(xì)胞代謝活性（例如MTT法）以及檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性等生物學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)不同檢測(cè)原理開(kāi)展細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，可從不同角度揭示化合物細(xì)胞毒性的作用機(jī)理。

中性紅吸收試驗(yàn)是廣泛接受的用來(lái)評(píng)價(jià)藥物、化妝品、工業(yè)化工原料及環(huán)境污染物對(duì)不同細(xì)胞的毒性的體外細(xì)胞毒性測(cè)試方法。在眾多細(xì)胞毒性測(cè)試方法中，中性紅試驗(yàn)是最為靈敏的評(píng)價(jià)卷煙煙氣冷凝物細(xì)胞毒性的方法。然而，該方法是否可用于評(píng)價(jià)電子煙煙液細(xì)胞毒性還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明基于中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)的原理，根據(jù)電子煙煙液細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，通過(guò)篩選適用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的細(xì)胞系，優(yōu)化染毒濃度，建立的一種電子煙煙液體外細(xì)胞毒性的測(cè)定方法，該方法具有檢測(cè)通量高，靈敏度高，定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法，包括以下步驟：?

1）?溶液的制備：

（1）中性紅染液：0.2?g中性紅加雙蒸水至100?ml，過(guò)濾除菌并用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至50?μg/ml；

（2）中性紅萃取液：冰醋酸∶無(wú)水乙醇∶水＝1∶50∶49；

（3）陽(yáng)性對(duì)照：十二烷基硫酸鈉（SDS）（200?μg/ml，100%?細(xì)胞致死率濃度）；

（4）電子煙煙液染毒溶液：由于電子煙煙液的主要組成成分包括丙二醇、丙三醇等保潤(rùn)劑，導(dǎo)致電子煙煙液溶液密度較大，無(wú)法準(zhǔn)確移取體積進(jìn)行染毒溶液的配制。因此，本發(fā)明中使用精度不小于萬(wàn)分之一的分析天平對(duì)電子煙煙彈液進(jìn)行準(zhǔn)確稱(chēng)量，然后使用細(xì)胞培養(yǎng)基溶液稀釋配制。

2）?細(xì)胞樣本的處理：

（1）細(xì)胞接種：本方法適用的細(xì)胞種類(lèi)為人肺正常上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞。向96孔板的每孔中加入100?μL的BEAS-2B細(xì)胞懸液。

（2）電子煙煙液染毒：細(xì)胞培養(yǎng)24?h后，吸去培養(yǎng)液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔為一組分別設(shè)置為陰性對(duì)照組、8個(gè)不同劑量的電子煙煙液染毒組和陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組每孔加入?100μl細(xì)胞培養(yǎng)基、電子煙煙液染毒組每孔加入100μl電子煙染毒溶液、陽(yáng)性對(duì)照組每孔加入200μg/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36個(gè)孔中每孔加入100μl稀釋培養(yǎng)液作為溶劑背景對(duì)照，于37?℃、5%?CO₂?條件下培養(yǎng)24?h。

（3）中性紅染色：電子煙煙液染毒24?h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入100?μl中性紅染液，于37?℃、5%?CO₂?條件下培養(yǎng)3?h。3?h后取出96孔板，吸去中性紅染液，每孔加入200?μlPBS洗2次，加入100ul中性紅提取液。室溫下快速振蕩15~20?min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)540?nm波長(zhǎng)處的吸光值。

（4）結(jié)果與分析：計(jì)算相對(duì)吸光值，相對(duì)吸光值代表細(xì)胞存活率。相對(duì)吸光值C=?A₅₄₀/?A_{540陰性對(duì)照}

注：所用SDS陽(yáng)性對(duì)照為100%細(xì)胞致死濃度，故A_{540陽(yáng)性對(duì)照}應(yīng)小于等于0.3。