[發(fā)明專(zhuān)利]一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)分子診斷方法及在施肥上的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410094874.8
• 申請(qǐng)日: 2014-03-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103923978A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡新喜;熊興耀;劉明月;馮燕青;何長(zhǎng)征;雷艷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;A01C21/00
• 代理公司: 北京知本村知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11039
• 代理人: 劉江良

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)與施肥管理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)的分子診斷方法，更具體地說(shuō)，采用Real?time?PCR的方法定量分析植株葉片硝酸還原酶NR基因的表達(dá)量，來(lái)判斷大田馬鈴薯植株的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，并確定是否需要施肥及具體的施肥量，為大田施氮管理提供指導(dǎo)。

背景技術(shù)

氮素是作物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素，它是植物體內(nèi)葉綠素、蛋白質(zhì)、核酸的組成部分，又是很多內(nèi)源激素的組成部分，占植物干重的1％～7％。葉綠素含量的高低，直接影響著光合作用的大小，并在一定的程度上反映了葉片含氮水平。氮肥管理對(duì)馬鈴薯種植效益和環(huán)境影響的起重要作用，而我國(guó)作物生產(chǎn)上普遍存在施氮水平過(guò)高，造成氮的浪費(fèi)和環(huán)境污染。氮肥供應(yīng)不足或過(guò)量，均會(huì)影響植物體內(nèi)的氮素代謝，從而破壞碳氮代謝平衡，降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。氮素供應(yīng)不足降低塊莖產(chǎn)量和大小，過(guò)多氮素供應(yīng)影響塊莖品質(zhì)如降低干物質(zhì)含量，硝酸鹽濃度增加，增加天冬酰胺積累，這會(huì)導(dǎo)致烹飪過(guò)程中形成丙烯酰胺。環(huán)境中的氮以硝酸鹽淋失和一氧化二氮排放方式流失。因此，最有效的方法是實(shí)現(xiàn)施氮與作物需氮的平衡，即根據(jù)作物的需要來(lái)施氮，但是在大田生產(chǎn)的情況下，要實(shí)現(xiàn)兩者的平衡存在很大的困難，因?yàn)椴煌攴荨⒉煌飰K之間的土壤供氮與作物需氮存在較大差異。目前常用的馬鈴薯氮素營(yíng)養(yǎng)診斷方法有植株外觀診斷、植株全氮診斷、土壤氮素測(cè)試、植株硝酸鹽快速診斷和葉綠素含量測(cè)定等方法，其中最為常見(jiàn)的光學(xué)方法是用葉綠素儀（SPAD502）測(cè)定葉綠素的相對(duì)含量（SPAD值），化學(xué)方法是硝態(tài)氮的含量，根據(jù)SPAD值和硝態(tài)氮的含量來(lái)評(píng)價(jià)植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況(Zebarth?and?Rosen，2007)，但是這些方法是間接測(cè)定方法，而且易受土壤中水分、養(yǎng)分等環(huán)境因素及馬鈴薯生育期的影響(Olfs?et?al.?2005)。植物通過(guò)基因表達(dá)的變化響應(yīng)逆境脅迫（Hazen?et?al.，2003），因此，基因定量表達(dá)可以提供一種衡量植株氮素充足與否更直接的措施。

當(dāng)土壤中供氮充足時(shí)，硝態(tài)氮作為非代謝物質(zhì)以一種半儲(chǔ)備狀態(tài)存在于植物液泡內(nèi)，因此植物體內(nèi)的硝態(tài)氮包括液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮（儲(chǔ)存庫(kù)）和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的硝態(tài)氮（代謝庫(kù)），當(dāng)植物需氮增加或缺氮時(shí),硝酸還原酶的活性增強(qiáng)，利用植物液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮，硝酸還原酶的活性與植物液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮存在對(duì)應(yīng)關(guān)系,?硝酸還原酶的活性和液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮比植株硝態(tài)氮的含量更直接和靈敏地反映作物對(duì)氮的需求，而液泡中儲(chǔ)備的硝態(tài)氮很難單獨(dú)測(cè)定,因此,可以用硝酸還原酶的活性或硝酸還原酶基因的表達(dá)水平代替全氮、硝態(tài)氮作為氮素營(yíng)養(yǎng)診斷指標(biāo)，來(lái)更準(zhǔn)確地估計(jì)植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況。Li等通過(guò)水培方法發(fā)現(xiàn)在缺氮情況下3天內(nèi)馬鈴薯試管苗硝酸還原酶和亞硝酸還原酶基因表達(dá)下調(diào)，但是在人工溫室條件下，采用營(yíng)養(yǎng)液，氮為硝態(tài)氮，設(shè)置的氮濃度梯度較少（氮濃度突然減少或大幅減少，充足(7.5?mM?NO₃^-),?有限（0.75?mM?NO₃^-)?，和缺氮?(0?mM?NO₃^-)?，采用的植株為瘦弱的試管苗（株高8-10cm，莖粗2-3mm），僅進(jìn)行短時(shí)間（7天）的培養(yǎng)，沒(méi)有涉及馬鈴薯塊莖的形成、膨大，更沒(méi)有涉及到產(chǎn)量，需要的氮少，而馬鈴薯生產(chǎn)是在田間進(jìn)行，采用的是種薯切塊種植，植株健壯（株高50-70cm，莖粗10-15mm）,土壤中本身含有一定濃度的氮素，種薯上含有一定的營(yíng)養(yǎng)供植株生長(zhǎng)前期吸收，田間施用的氮為尿素或者復(fù)合肥，不同于水培的硝態(tài)氮，施肥水平采用的不是摩爾濃度，而是單位面積施肥量（我國(guó)南方馬鈴薯普遍采用的是畝施15kg?純N），種植的時(shí)間為一個(gè)較長(zhǎng)的生長(zhǎng)季，在80天以上，包括馬鈴薯出苗期、苗期、塊莖形成期、塊莖膨大期和塊莖成熟期等5個(gè)時(shí)期，涉及到產(chǎn)量的形成，需要大量的氮，所以大田環(huán)境下的馬鈴薯植株遠(yuǎn)比水培試管苗復(fù)雜，Li等的研究結(jié)果對(duì)大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)診斷及施肥沒(méi)有任何借鑒意義。至今為止，還沒(méi)有以NR基因表達(dá)量作為衡量大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)現(xiàn)有間接測(cè)定方法的不足，提供一種高準(zhǔn)確率的NR基因表達(dá)量作為衡量植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的分子診斷方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)的分子診斷方法，是以馬鈴薯植株氮素吸收相關(guān)的硝酸還原酶基因NR的表達(dá)量作為診斷大田馬鈴薯植株氮素營(yíng)養(yǎng)狀況的分子標(biāo)記。